Bevezetés         Anyag és módszer        Eredmények     Megbeszélés   

Legfontosabb eredményeim és megállapításaim  Irodalom

A tézisek alapját képezõ közlemények

 

 

MTA DOKTORI TÉZISEK

 

az adenovírusok

filogenetikája

 

 

Harrach Balázs

 

 

 

Budapest

2001

 

[ugrási lehetõség az idézett cikkek adataihoz, majd onnan az összefoglalóikhoz vagy teljes szövegükhöz, a DNS- és aminosav-szekvenciákhoz, a szekvencia-illesztésekhez, a nexus-formátumú (tetszõlegesen megjeleníthetõ) és grafikusan megjelenített “evolúciós” fákhoz, háromdimenziós (mozgatható) fehérje-képekhez, a felhasznált (letölthetõ) számítógép-programokhoz]

 

 

BEVEZETÉS

 

Téziseimben azokat a számítógépes filogenetikai analízisen alapuló összehasonlító molekuláris virológiai munkáinkat és evolúciós következtetéseimet foglaltam össze, amelyek alapját képezték az Adenoviridae család rendszertanának gyökeres megújítását célzó javaslatainknak.

            Az adenovírusok régóta és alaposan tanulmányozott vírusok, a vizsgált típusok kiválasztása azonban a legutóbbi idõkig meglehetõsen egyoldalú volt. Amíg az ember és a gazdaságilag fontos háziállatok könnyen szaporítható adenovírusairól számos molekuláris biológiai szintû adat gyûlt össze, addig az egzotikus (pl. alacsonyabbrendû gerinces) állatok adenovírusairól, illetve a nehezen szaporítható típusokról máig is keveset tudunk. A hivatalos rendszertan jelenleg is csak a Mastadeno- és Aviadenovirus genust ismeri el, noha adenovírusok jelenlétét halakban, kétéltûekben és hüllõkben is leírták, és ezek nyilvánvalóan nem tartozhatnak az emlõs- vagy madár-adenovírusokhoz.

            Amikor immár több mint tíz évvel ezelõtt az adenovírus kutatásba bekapcsolódtam, épp csak elindultak azok a hazai kutatási pályázatok és tudományos együttmûködések, amelyeknek témája egy különleges víruscsoport, az úgynevezett 2. alcsoportba tartozó szarvasmarha-adenovírusok molekuláris biológiai tanulmányozása volt. Témaválasztásom nem véletlenszerû volt: a háziállatok adenovírusos fertõzöttségének illetve megbetegedéseinek kutatása nagy hagyományokkal rendelkezett Magyarországon mind az állategészségügyi intézetekben, mind az Állatorvos-tudományi Egyetem Járványtani Tanszékén, mind pedig kutatóintézetünkben. A hazai humán adenovírus (HAdV) kutatások ugyancsak magas színvonalon és az állatorvosokkal gyümölcsözõ együttmûködésben folytak (Belák et al., 1983; Ádám et al., 1988). Méltán nevezték hazánkat “adenovírus-nagyhatalomnak”. Mint a molekuláris virológia iránt érdeklõdõ magyar állatorvosnak kézenfekvõ volt egy olyan állati adenovírus csoport, a bovin adenovírusok (BAdV) 2. alcsoportja, részletes tanulmányozásába kezdenem, melynek elsõ tagjait Magyarországon izolálták és írták le a világon elõször. Különleges biológiai tulajdonságaik alapján Bartha professzor (1969) már szinte felfedezésükkel egyidõben felismerte, hogy e vírusok taxonómiai megkülönböztetése indokolt lenne. Az akkor nemrég megalakult Nemzetközi Vírusrendszertani Bizottság (ICTV) azonban exakt bizonyítékok hiányában a nemzetség-szintû átsorolást elnapolta, így csak a Mastadenovirus nemzetségen belül különítették el a szarvasmarha adenovírusok 2. alcsoportját (Wigand et al., 1982).

            Az adenovírusok közepes méretû, buroknélküli, ikozaéder-alakú, dupla-szálú DNS-vírusok. Legnagyobb mennyiségben elõforduló fehérjéjük, a kapszidot alkotó hexon, típus-, csoport- és genus-specifikus immunreakciókért felelõs (Ádám et al., 1996). Az adenovírusok jellegzetes elektronmikroszkópos képét a kapszid csúcsairól kinyúló antennaszerû fehérjeképletek, a fiberek adják, amik a virion sejthez való kapcsolódásában játszanak fontos szerepet, és meghatározzák a vírus sejt-tropizmusát is. Az egyes izolátumokat vírus-neutralizációs próbák eredménye alapján sorolták szerotípusokba, és a szerotípusokat sokáig a faj (species) kategóriájaként tartották számon. A legtöbb adenovírus gazdaspektruma szûk. Általában fiatal egyedekben alakítanak ki enyhe tünetekkel járó felsõlégúti betegséget, de a tünetmentes, rendszerint perzisztens fertõzés is gyakori. Generalizált, súlyos kimenetelû betegséget csak különbözõ okok (AIDS, szerv-transzplantáció, citosztatikus kemoterápia, stb.) miatt nem immunkompetens gazdában okoznak. Elõfordulnak azonban olyan típusok is, amelyek fogékony háziállatokban jellegzetes, súlyos tünetekkel vagy éppen elhullással is járó betegséget képesek elõidézni (pulykák vérzéses bélgyulladása, Rubarth-kór).

            Az emberi adenovírusok intenzív kutatása mára 51 szerotípus felismerését, a virion felépítésének meglehetõsen pontos leírását és öt HAdV-típus teljes genom-szekvenciájának megismerését eredményezte. Elterjedt vélekedés volt, hogy az állati adenovírusok szerkezete és genomja is a humánokéhoz hasonló lehet. A gazda- (emlõs vagy madár) eredet alapján két (Mast- illetve Aviadenovirus) nemzetségbe sorolt vírusok között egyetlen morfológiai különbség az volt, hogy a madár-adenovírusok minden csúcsán két, általában eltérõ hosszúságú, fibert lehetett megfigyelni. Szerológiailag is megkülönböztethetõ volt a két csoport, amennyiben tagjaik genus-specifikus közös komplementumkötõ antigénnel rendelkeztek, amit agar-gél-immundiffuzióval is ki lehetett mutatni. A két-genusos rendszertan hiányosságaira már viszonylag korán felhívták a figyelmet azok az izolátumok, amelyek nem egyértelmûen illettek a gazdafaj szerinti nemzetségbe. Az ún. 2. alcsoportbeli BAdV-ok különleges biológiai tulajdonságai (primer borjúhere-szövethez kötött replikáció, alacsony titer, sajátos magzárványok, fokozott hõtûrõképesség) között olyan is akadt (agar-gél immundiffuzióban hiányzik a keresztreakció a többi mastadenovírussal), ami egyéb esetekben általában a genusba sorolás feltétele volt. Ugyanígy, viszonylag korán kiderült, hogy a fogékony házityúk-állományokban komoly veszteségeket okozó EDS- (egg drop syndrome) vírus eltér a madár-adenovírusoktól, és nem rendelkezik a nemzetségre jellemzõ közös antigénnel. Egy további madár-eredetû adenovírus is nagyon különlegesnek bizonyult: a pulykák vérzéses bélgyulladását okozó vírus (“turkey haemorrhagic enteritis virus”, THEV), ami fácánokban ún. márványlép-betegséget (MSD), házityúkban pedig lép-megnagyobbodással járó kórképet (splenomegalia) idéz elõ. Bár minden madárból izolált AdV-t az Aviadenovirus nemzetségbe soroltak, azt a fenti vírusok miatt három csoportra kellett osztani: a nagyszámú “klasszikus” aviadenovírus (I. csoport) mellett elkülönítve a THEV-szerû vírusokat (II. csoport) és az EDS-vírust (III. csoport).

Benkõ és munkatársai (1988) a DNS restrikciós enzimes (RE) analízisével megállapították, hogy ezeknek a különleges BAdV-oknak kb. 20-30 százalékkal kisebb a genomjuk, mint az 1. alcsoportba sorolt és a humán adenovírusokra jobban hasonlító BAdV-1 vagy BAdV-3 vírusé (Benkõ és Harrach, 1990). Késõbb molekuláris klónozással és DNS-hibridizációs kísérletekkel megállapítottuk, hogy a két alcsoportba tartozó BAdV-ok között komoly szekvencia hasonlóság (hibridizálással) nem mutatható ki, azaz genetikailag nem tekinthetõk közeli rokonoknak (Benkõ et al., 1990).

Célul tûztük ki, hogy DNS-szekvencia szinten is megismerjük ezeket a különleges BAdV-okat, és az akkoriban még újdonságnak számító (sõt megkérdõjelezett) számítógépes filogenetikai analízist alkalmazzuk különbözõségeik kvantitatív jellemzésére. Munkánk kezdetekor egyetlen 2. alcsoportbeli BAdV-ból származó gén volt ismert. Az eltelt idõ folyamán szerencsénkre az állati adenovírusok tanulmányozása is egyre intenzívebbé vált, legelsõsorban azért, mert a rekombináns technikával elõállított adenovírus-alapú génkifejezõ vektorok igen hatékony, stabil, biztonságos és jól kezelhetõ rendszernek bizonyultak (Tuboly et al., 1993; Tuboly és Nagy, 2001). A téma népszerûsödése nyomán a rendelkezésre álló génszekvenciák illetve teljes genomok mennyisége ugrásszerûen megnõtt, ami nagyban elõsegítette filogenetikai elemzéseink tökéletesedését. A fokozatosan felismert taxonómiai viszonyok alapján folyamatosan javaslatokat nyújtottunk be az ICTV-hez, kezdetben nem sok sikerrel. Az áttörést az 1998-as év jelentette, amikor korábbi erõfeszítéseinkre végre felfigyeltek, és témacsoportunkra bízták az ICTV Hetedik Jelentéséhez az Adenoviridae családról szóló fejezet összeállítását (Benkõ et al., 2000). Mivel ebben a kiadásban már kötelezõen szerepelt a vírusfaj fogalmának pontos meghatározása minden egyes család esetében, kénytelenek voltunk ezt a feladatot is felvállalni. Mivel a humán és madár-adenovírusok kivételével az új speciesek kialakításához igen kevés adat állt rendelkezésünkre, ez a feladat igen nagy lendületet adott ahhoz, hogy szekvenáló és elemzõ vizsgálatainkat a laboratóriumunkban megtalálható illetve vizsgálatra kapott különféle gazda-eredetû adenovírusok minél szélesebb körére kiterjesszük.

A nemzetség-szintû besorolás néhány olyan érdekes, kezdetben bizarrnak tûnõ eredményhez vezetett, hogy szükségesnek láttam bizonyos vírusok gazdafaj-eredetének pontosabb megvizsgálását. Úgy véltem, hogy csak az “egzotikus” adenovírusok molekuláris szintû tanulmányozása adhat kulcsot az Adenoviridae család evolúciójának, a genom-szervezõdés fejlõdési irányának megértéséhez. A kapott eredmények egyértelmûen arra utalnak, hogy e vírusoknál több esetben meglepõ gazdaváltás következett be. E gazdaváltások figyelembe vételével végül is sikerült az adenovírusok evolúciójának legvalószínûbb irányát és nagy lépéseit felvázolnom. Eddigi vizsgálataink e hipotetikus evolúciós utat nem cáfolják.

 

 

ANYAG ÉS MÓDSZER

 

Vírus-törzsek és elemzésre kapott DNS-szekvenciák eredete

 

Vizsgálatainkhoz számos magyar illetve külföldi kolléga nyújtott segítséget különbözõ emlõs- (Bartha Adorján, Rusvai Miklós, Brian Adair), madár- (Sághy Erzsébet, Palya Vilmos, Brian Adair), kígyó- (Winfried Ahne) és hal-eredetû (Scott LaPatre) vírustörzsek rendelkezésünkre bocsátásával. A kígyó-adenovírusok király pitonból (Python regius) és gabonasiklóból (Elaphe guttata) származtak, a hal-adenovírust pedig fehér tokból (Acipenser transmontanus) izolálták. Adenovírus fertõzöttségre (MSD, THE, stb.) gyanús mintákat biztosított Ivanics Éva, Baska Ferenc, Erdélyi Károly, Földi József, Hajtós István és Vlado Savic. Mindnyájuknak szeretném köszönetemet ezúton is kifejezni.

 

Molekuláris klónozás és DNS-szekvenálás

 

A BAdV-okat alacsony passzázs-számú borjúhere- vagy (az 1. alcsoportbelieket) borjúvese-sejttenyészeten, illeve MDBK-sejtvonalon szaporítottuk, míg az ovin adenovírusokat (OAdV) alacsony passzázs-számú bárányvese-sejteken. Az ultracentrifugálással cukorpárnán át ülepítve tisztított vírusok DNS-ét SDS- és proteináz-K-kezelés után fenolos kivonással és alkoholos kicsapással tisztítottuk. Esetenként közvetlenül a vírussal fertõzött sejttenyészetbõl nyertünk vírus-DNS-t a Shinagawa (1983) által ajánlott eljárással. Általában véletlenszerû molekuláris klónozás alkalmaztunk. A genom-végekrõl alkalikus kezeléssel távolítottuk el a terminális protein esetleges maradványait, majd tompa- és ragadós véget eredményezõ két restrikciós enzimmel vágott klónozó vektorba (pBluescipt SK, pMOB, pUC19, pKH47, pBR322) klónoztuk. Némelykor fizikális térképezést alkalmaztunk, majd direkt klónozással egyenként építettük be az elektroforézissel elkülönített ismert fragmentumokat.

A klónozott virális genom-szakaszok DNS-sorrendjét a végeik felõl a plazmidokhoz illõ szekvenáló primerekkel (univerzál, reverz, T3, T7) határoztuk meg kezdetben izotópos (32P vagy 35S) Sanger-féle dideoxi-láncterminációs módszerrel (Benkõ Mária, Harrach Balázs, Ruzsics Zsolt), a késõbbiekben pedig automata szekvenálóval, Pharmacia ALF (Johan Béla Országos Epidemiológiai Központ, Bánrévi Andrea) vagy ALF Express rendszeren (Országos Állategészségügyi Intézet, Ursu Krisztina, Élõ Péter), illetve ABI377-es gépen (MTA Szegedi Biológiai Központ, Pay Anikó, Kószó Zsuzsanna). A szekvenálással nyújtott segítséget hálásan köszönöm.

A teljes szekvenálásra kiválasztott molekulárisan klónozott vírusgenom-szakaszokat különbözõ módszerekkel készítettük elõ. Szubklónozást, direkt klónozás alkalmaztunk, ha ismertük a szekvenálandó szakasz fizikális térképét, vagy legalább néhány fontosabb RE felismerési hely elhelyezõdését. Ha nem állt rendelkezésünkre fizikális térkép, magunk kerestünk vágási helyeket és azokat felhasználva visszavágásokkal rövidítettük a vizsgálandó virális DNS-t kiejtve a klónozóhelyekig (“multiple cloning site”) terjedõ részt. Kipróbáltunk egy ugrálógénes (transzpozonos) technikát is, amelynek során a szekvenálandó szakasz különbözõ pontjaira beépült TN1000 transzpozon végei felõl lehetséges a DNS-sorrend meghatározása a transzpozonhoz tartozó primerek segítségével. A szükséges klónok ugyan órák alatt elõállíthatók, ám a nagyméretû (6000 bp) transzpozon miatt, amit ráadásul minél hosszabb vizsgálandó DNS-szakasz esetén érdemes alkalmazni, gyakran problémáink voltak megfelelõ töménységû DNS elõállításával. Néha egyes szakaszok “kiestek”, valamint a beépülés helyének megállapítása csupán RE vágásokkal nem mindig volt lehetséges. Exonukleáz III technikával gyorsan és irányított mértékben tudtunk sorozatos visszavágásokat elérni, de bizonyos genom-szakaszokkal nem boldogultunk (feltehetõleg a cél-DNS konformációja miatt). Néhány rövidebb szakaszt, az utolsó megismert szekvencia-rész alapján tervezett egyedi primerrel szekvenáltattunk (“primer walking”). Ennek különleges esete volt, amikor egy klónozott szakasz végére tervezett primer segítségével sikerült tisztított vírus-DNS-t közvetlenül szekvenálni, anélkül, hogy klónoznunk kellett volna (Szathmáry et al., 1997).

 

Számítógépes szekvencia-analízis

 

A nyert DNS-szekvenciákat Blast (NCBI, USA) homológia vizsgálatnak vetettünk alá a klónozott genom-szakasz azonosítására és a téves klónozások kiszûrésére. Az interneten keresztül a GenBank (NCBI) adatbázisát használtuk. Az ott található adatok problémás minõsége miatt (elnevezésbeli hibák, ismétlõdések, bizonyos szekvenciák hiánya), összeállítottunk egy internetes nyilvános (az Intézet linux-szerverén elérhetõ) adatbázist (http://www.vmri.hu/~harrach/ADENO1.htm), mely válogatott, javított és bõvített adenovírus-szekvencia adatokat tartalmaz, és egy ezt használó Blast szolgáltatást (http://www.vmri.hu/blast.htm). A belsõ használatra készült munka-adatbázis tartalmazza a nem közölt (nem végleges) saját szekvenciáinkat is. DNS- és aminosav-szekvencia gyûjteményünk windows alapú személyi számítógépeken a BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/RnaseP/info/ programs/BIOEDIT/bioedit.html) beépített Blast programjával vizsgálható.

Az egymást átfedõ DNS-szekvenciák összeillesztését a PC/Gene (IntelliGenetics) vagy a LaserGene (DNASTAR) programcsomagok Assemgel és SeqMan II programjainak segítségével végeztük. A DNS- és aminosav-szekvenciákat részben e két programcsomag segítségével elemeztük (DNS-szekvencia lefordítása különbözõ leolvasási keretekben, GC% számítása, kódon-használat, stb.). Ezenkívül internetes szolgáltatásokat és ingyenes célprogramokat alkalmaztunk az alábbiak szerint.

A Biology WorkBench 3.2 (http://workbench.sdsc.edu) programgyûjtemény a Blast homológia kereséssel talált hasonló szekvenciák válogatását, összeillesztését és vizsgálatát könnyíti meg. Kiválaszthatók, pl. a GenBank vírusszekvencia gyûjteményébõl, a valóban homológ szekvenciák, majd a programcsomag lehívja ezek teljes szekvenciáját és ClustalW programmal hasonlósági illesztést (“alignment”) végez.

A filogenetikai számításokat a PHYLIP-programcsomag különbözõ programjaival (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html) végeztük, ahogy azt részletesen leírtuk (Harrach és Benkõ, 1998a). DNS- és aminosav-szekvencia-illesztéseket vizsgáltunk parszimónia és távolsági mátrix (“distance matrix”) analízissel; a kapott fákat a TreeView programmal (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html) jelenítettük meg.

A gazdaállatokra vonatkozó evolúciós fa részben mitokondriális riboszóma-RNS kis alegység-szekvenciákon és FastDNAml (maximális hasonlóság, “maximum likelihood”) számításokon alapult, és a Riboszómális Adatbázisból (Ribosomal Database) származik (Maidak et al., 1997; http://rdpwww.life.uiuc.edu/index2.html). Néhány esetben alkalmaztuk a tirozináz-gént is (a PHYLIP-programcsomag Protdist és molekuláris órát használó Kitch programjaival).

 

 

EREDMÉNYEK

 

Adenovírusok molekuláris klónozása és szekvenálása

 

Elkészítettük a BAdV-1 (Benkõ és Harrach, 1990), BAdV-4 (Benkõ et al., 1990) és BAdV-10 (Matiz et al., 1996) fizikális térképét. A BAdV-4 és 10 teljes genomját klónoztuk, valamint számos adenovírus különbözõ genom-szakaszait: BAdV-1–3, 6, 7, 9, OAdV-1, 3, 5, EDS-vírus, gabonasikló és fehér tok adenovírusai. Más adenovírusok genom-szakaszait PCR-rel nyertük (Kiss et al., 1996a, b): tyúk-adenovírus 1-4, 6-11, fácánok márványlép-betegségének vírusa, THEV, piton-AdV.

A GenBankba eddig az alábbi szekvenciákat nyújtottuk be (a részleges génszekvenciák zárójelben):

 

Mastadenovírusok

BAdV-1        pVIII, E3-régió, (fiber)                         AF038868    2607 bp   1997. XII.        Evans et al., 1998

BAdV-2        (protein III), pVII, pV, pX, (pVI)        U44123         2609 bp   1995. XII.        Rusvai et al., 2000

                      (hexon), proteáz, (DBP)                      U44124           836 bp   1995. XII.    Barbezange et al., 2000

                      fiber, 17K                                              AF308811    2496 bp   2000. IX.         Izadpanah et al., 2001

BAdV-10      (52K)                                                     U25263           405 bp   1995. IV.         Smyth et al., 1996

                      (pIIIa)                                                    U25262           514 bp   1995. IV.         Smyth et al., 1996

                      proteáz, (DBP)                                     AF027599      897 bp   1997. IX.         Matiz et al., 1998

                      ITR                                                        AF238882      368 bp   2000. II.           Dán et al, 2001

OAdV-3       (hexon), proteáz, (DBP)                      AF153447    2099 bp   1999. V.           Barbezange et al., 2000

macska-adenovírus izolátum (hexon)                     AF172246      301 bp   1999. VII.        Lakatos et al, 1999

Atadenovírusok

BAdV-4        (pVI), hexon, (proteáz)                        AF036092    3220 bp   1997. XI          Dán et al., 1998

ITR                                                        AF238883        59 bp   2000. II.           Dán et al., 2001

                      teljes genom                                         AF036092 30100 bp  2001. II        Dán et al., 1997, kézirat

BAdV-5        ITR                                                        AF238881        67 bp   2000. II.           Dán et al., 2001

BAdV-6        ITR                                                        AF238880        74 bp   2000. II.           Dán et al., 2001

EDS-vírus    (hexon), proteáz, (DBP)                      U63515         1053 bp   1996. VII.    Harrach et al., 1997

Erszényes róka-AdV penton                                   AF249332 1344 bp    2001. I.              Thomson et al., benyújtva

                      hexon                                                    AF338822    2724 bp   2001. I.            Thomson et al., kézirat

                      proteáz                                                  AF338823                    2001. I.             Thomson et al., kézirat

Aviadenovírusok

Tyúk-adenovírus több típusa  (hexon)                                        benyújtása folyik          Papp et al., 2001

Siadenovírusok

Béka-AdV 1 teljes genom                                        AF224336  26163 bp  2000. I.             Davison et., 2000

Fácán márványlép betegség vírusa, proteáz, pVIII (hexon) benyújtása most folyik 

 

A kapott nukleotid-sorrend százalékos GC arányát minden esetben megvizsgáltuk. Az eltérõ kódon-használat demonstrálásra jelrendszereket dolgoztunk ki (pl. l, L, l, L, l, L a leucint kódoló tripletek megjelenítésére) (Harrach és Benkõ, 1990).

A vírusgenom szervezõdésérõl részleges szekvenciák alapján is adatokat nyertünk a jellegzetes gének és genom-régiók vizsgálatával (Matiz et al., 1998; Szathmáry et al., 1997).

 

Egyedi gén-szekvenciákon alapuló számítógépes összehasonlítás

 

Elsõsorban a proteáz, hexon, pVIII, DNS-polimeráz és penton-gén DNS- és aminosav-szekvenciákat tanulmányoztuk számítógépes filogenetikai analízissel.

(Kiegészítõ ábrák az interneten: hexon aminosav-szekvenciák illesztése Phylip-formátumban a számításokhoz nem használható „oszlopok” kivágása után; a distance matrix analízis eredménye NEXUS formátumban.) Az 1. ábra a hexon aminosav-szekvenciák távolsági analízissel nyert elemzését mutatja. Hasonló csoportosítást eredményezett minden tanulmányozott gén és fehérje vizsgálata, akár DNS-, akár aminosav-szekvenciákat elemeztünk, függetlenül attól, hogy parszimónia vagy távolsági mátrix analízist végeztünk.

 

 

 

MEGBESZÉLÉS

 

Bár az érthetõség kedvéért és a csoportunk által közösen végzett munka kiterjedtségének vázolása érdekében az eredményeknél felvillantottam számos munkát, amit az átfogó adatgyûjtés érdekében végeztünk tanítványainkkal, téziseimnek fõ témája a nyert DNS- és származtatott aminosav-szekvenciák számítógépes filogenetikai analízise és értelmezése, ezért igyekszem ezek megvitatására szorítkozni.

 

A 2. alcsoportbeli BAdV-ok filogenetikai távolsága a mastadenovírusoktól

 

Munkám kezdetekor a BAdV-7 proteáz-génjének kivételével nem volt ismert szekvencia a. 2. alcsoportbeli szarvasmarha-adenovírusokból (BAdV-4–8). Mint korábban említettem, Bartha Adorján már 1969-ben felismerte, hogy e vírusok biológiai és szerológiai tulajdonságaik alapján annyira eltérõek az összes többi emlõsállat adenovírusától, hogy rendszertani elkülönítésük indokolt lenne, de az akkori technika nem tette lehetõvé az eltérés mértékének kvantitatív meghatározását, vagy olyan bizonyítékok összegyûjtését, amelyekkel e felismerést rendszertani szinten is el lehetett volna fogadtatni. A molekuláris biológiai eszköztár kifejlesztése teremtette meg a lehetõséget a vírusok evolúciós távolságának kvantitatív tanulmányozására (Harrach, 1998).

A 2. alcsoport tagjainak nukleotid-sorrendje meglepõen alacsony (34-42%) GC-tartalmú genomról tanúskodott a korábban megismert adenovírus-szekvenciákhoz képest (43-64%). Ezt a magas AT-arányt javasoltuk az új nemzetség nevében tükrözni: Atadenovirus genus (Benkő és Harrach, 1998; Harrach és Benkõ, 1998a).

            Az idõközben teljes egészében megszekvenált tyúk-adenovírus 1 (CELO) és 9 (A2) genom-analízise azt mutatta, hogy a két tradicionálisan elfogadott genus kissé eltérõ genom-szerkezettel rendelkezik (Chiocca et al., 1996; Ojkic és Nagy, 2000), ami nem váltott ki nagy meglepetést. Szekvenálásaink azonban azt mutatták, hogy a 2. alcsoportbeli BAdV-ok a két genusétól eltérõ, harmadik típusú genom-szerkezettel rendelkeznek. E felfedezésünkkel egyidõben ausztrál kutatók leírták egy juh-adenovírus (OAV287-es törzs) teljes genom-szekvenciáját és genom-analízisét (Vrati et al., 1996). Meglepõ eredményeiket összegezve, e juh-adenovírust mint egy rendkívül különleges adenovírust jellemezték. Késõbb sikerült befejeznünk a BAdV-4 teljes genomjának DNS-szekvenálását (Dán et al., 1997; Benkõ et al., 2001). Ezenkívül a BAdV-5, 6, 7, és az önálló típus-számmal még nem rendelkezõ Rus-izolátum (Zakharchuk et al., 1993) hosszabb genom-szakaszainak bázissorrendjét is meghatároztuk (Szathmáry et al., 1997). Eredményeinket összevetve világossá vált, hogy az OAV287-es törzs és a 2. alcsoportbeli BAdV-szerotípusok genom-szervezõdése azonos, és valóban jelentõsen különbözik a mastadenovírusok genomjától. Egyes gének hiányoznak, illetve teljes genom-régiók nem azonosíthatók. Nevezetesen a protein V és IX génje, valamint három korai régió (E1, E3 és E4) nincs jelen e vírusokban (Benkõ és Harrach, 1998; Szathmáry et al., 1997; Benkõ et al., 2001). Mivel ezeket a genom-részeket minden korábban vizsgált (emlõsállatból izolált) adenovírusban megtalálták, eleinte hihetetlennek tûnt a felfedezett eltérés. Az ausztrál kutatók maguk is mindenáron erõltették a korai régiók homológjainak azonosítását. Például nyomokban fellelhetõnek vélték az E1B-régiót a mastadenovírusoknál megszokott elhelyezkedésben. Az itt található géneket, amik az Atadenovirus nemzetség tagjaiban mindig nagyon hasonlítanak egymásra, máig is E1B-régiónak nevezik, holott a nagyon alacsony pontszámmal kimutatott egyetlen hasonló mastadenovírus-gén homológiája nem tekinthetõ bizonyítottnak. Feltételezték továbbá az E3-régió áthelyezõdését, csupán azon az alapon, hogy a fiber-gént követõen találtak egy kivágható genom-szakaszt (és az E3 is nélkülözhetõ a vírus számára). Az E4 áthelyezõdését szintén egy nagyon alacsony pontszámú, feltételezett homológia alapján mondták ki. Egyszerûbbnek látszik azonban elfogadni, hogy a mastadenovírusok E1, E3 és E4 régióinak homológjai nem léteznek és valószinûleg soha nem is voltak jelen az atadenovírusok genomjában. Ugyanakkor az atadenovírusok tartalmaznak más géneket és korai gén-régiókat hasonló genom-elhelyezõdésben. Például egy struktúrális prekurzor fehérje- (p32K) gén található az E1A helyén, három korai gén az E1B helyén, valamint további korai gének a genom jobb végén (Vrati et al., 1996; Benkõ et al., 2001).

A bioinformatikai eszközökkel (homológia kereséssel) azonosított géneket kvantitatív, számítógépes filogenetikai elemzéssel vizsgálva bizonyítottuk, hogy a BAdV 2. alcsoport tagjai hasonló filogenetikai távolságra helyezkednek el a mastadenovírusoktól, mint az önálló genusnak elfogadott aviadenovírusok (1. ábra; Benkõ és Harrach, 1994; Harrach et al., 1996). Következtetésünk az volt, hogy e BAdV-okat egy új (harmadik) genusba kell elkülöníteni a genetikai távolság alapján (Benkő és Harrach, 1998; Dán et al., 1998; Harrach és Benkõ, 1998a és b). A filogenetikai számítások ugyanebbe a csoportba sorolták az OAV287-es törzset is.

 

A kacsa-adenovírus 1 rokonsága a szarvasmarha-adenovírusokkal

 

A kacsa-adenovírus 1 (EDS-vírus) proteináz-gén DNS-szekvenciájával és filogenetikai analízissel bizonyítottuk a meglepő tényt, hogy ez a madárból izolált vírus közeli rokona a 2. alcsoportbeli BAdV-oknak (Harrach et al., 1997). Közös vírusnemzetségbe való beosztásukat javasoltuk (Atadenovirus genus), annak ellenére, hogy más gerinces osztályba tartozó állatokból származnak (Benkő és Harrach, 1998). Időközben közölték az EDS-vírus teljes nukleotid-sorrendjét, és kiderült, hogy genom-szerveződése nagyjából azonos a kérődzőkből izolált atadenovírusokéval (Hess et al., 1997). Az egyetlen eltérés az, hogy az EDS-vírus genomja hosszabb, a jobb végén található egyedi szakasszal, amelynek elemzése még nem fejezõdött be.

A korábbi nevezéktan a háziállatok minden adenovírusát a Mastadenovirus vagy az Aviadenovirus nemzetségbe sorolta. E nevek egyedül a gazdafajra utalnak, és annak jelentõségét hangsúlyozzák (bár a szerológiai keresztreakció hiánya is jól elkülönítette ezeket a vírusokat). Így javaslatunk, hogy bizonyos emlős és madár-adenovírusokat egy új közös genusba soroljunk, valóban meglepőnek tûnhetett. Első lépésben nem is sikerült többet elérnünk, mint a javasolt atadenovírusok eltávolítását a Mastadenovirus illetve Aviadenovirus nemzetségből, és átsorolásukat a “be nem sorolt adenovírusok” közé (Benkõ et al., 2000).

 

Egy erszényesből izolált adenovírus

 

Új-Zélandban az erszényesróka (közönséges rókakuzu, Trichosurus vulpecula) béltartalmában elektron-mikroszkóppal adenovírusok jelenlétét mutatták ki. A vírus vizsgálatát megnehezítette, hogy szövettenyészeten nem sikerült izolálni, ezért minden egyes szekvenálható DNS-szakaszt PCR-technikával kellett kinyerni. Az első szekvenciák arra utaltak, hogy egy újabb atadenovírusról lehet szó. Új-zélandi kollégáink ekkor felvették velünk a kapcsolatot, és további PCR primerek tervezése céljából különbözõ, még nem közölt DNS-szekvenciákat bocsátottunk a rendelkezésükre. Mostanra hosszú szakaszokat lehetett felerősíteni és szekvenálni. A filogenetikai számítások megerősítették, hogy az erszényesróka adenovírusa valóban az atadenovírusok nemzetségébe tartozik (Thomson et al., 2001). Az eddig megismert genom-szerveződési adatok szintén alátámasztják ezt, pl. megállapítottuk az V-ös struktúrprotein génjének hiányát.

 

Magyarázat az atadenovírusok hasonlóságára

 

Az atadenovírusok különlegességének elfogadását nehezítette, hogy sem az alaposan tanulmányozott humán, sem pedig a többi emlősállatból izolált adenovírus között egyetlen hasonlót nem írtak le. Különbözõ kérődző-fajokban azonban (kecske, szarvas, stb.) újabban több atadenovírust találtak (Lehmkuhl és Cutlip, 1999), és mára a kérődzőkből izolált adenovírus típusoknak közel a fele idetartozik. Mi lehet a magyarázata, hogy ezek a különleges vírusok csak kérődzőkben, kacsában (onnan csirkére is terjedve) és erszényesben fordulnak elő? Feltételezzük, hogy az atadenovírusoknak közös az eredete, valamilyen más (nagyon eltérő) állatcsoporttal fejlődhettek együtt az evolúció során, és viszonylag “nem régen” adaptálódtak a ma ismert új gazdákhoz. Az atadenovírusok jelenléte három ennyire távoli rendben/alrendben arra enged következtetni, hogy ez a gazdaváltás három eltérő időpontban történt, feltehetõen az után, hogy a gazdaállatok elkülönültek egymástól az evolúció során, mivel eddigi ismereteink szerint más állatfajokban atadenovírusok nem fordulnak elõ és nincs okunk kihalásukat bizonyos gazdában feltételezni. Az eredet kiderítése céljából összehasonlítottuk a gazdaállatok és a belőlük izolált vírusok filogenetikai fáját.

A gazdaállatok evolúciós fáját olyan génnel kívántuk ábrázolni, amely minél több fajból rendelkezésünkre állt. Elsőként a mitokondriális riboszóma-RNS kis alegységét választottuk (Harrach, 2000). Sajnos ez a gén nem alkalmas a régebbi evolúciós történések rekonstruálására, mert a kapott törzsfejlődési fa nem mutatja mindig helyesen a gerincesek evolúciós távolságát. Ezért csak hozzávetőleges következtetés levonására használható. Azt mindenesetre látni, hogy az atadenovírusok olyan evolúciós távolságra vannak a többi adenovírustól, hogy eredeti gazdáikat valamilyen alacsonyabbrendű gerincesben lehet feltételezni. A kérdés pontos meghatározása azonban (e gén esetében mindenesetre) meghaladta a számítások feloldóképességét. Ezért az eredet megállapítása céljából hozzákezdtünk az alacsonyabbrendű gerincesekből (hal, béka, kígyó) izolált adenovírusok molekuláris jellemzéséhez.

 

A béka-adenovírus közeli rokona a pulyka-HEV-nek

 

Kézenfekvõnek látszott a béka-adenovírus vizsgálata, mivel ez a vírus, és a szaporításához felhasználható sejtvonal megvásárolható az American Type Culture Collection-tõl. Kiderült, azonban, hogy Skóciában már meg is kezdték e vírus DNS-ének szekvenálását. A filogenetikai elemzéshez és a kapott eredmények értelmezéséhez együttmûködésre kértek fel. Analízisünk azt a meglepõ eredményt adta, hogy a béka-adenovírus a pulykák vérzéses bélgyulladásának vírusával (THEV, pulyka-adenovírus 3) mutat nagyon közeli rokonságot (Davison et al., 2000). E meghökkentõ eredményt magyarázhatja elméletünk, miszerint a madarakból izolált THEV eredetileg a kétéltûekkel fejlõdött együtt. Emlékeztetõül megjegyzem, hogy a THEV nem ad szerológiai kereszt-reakciót az aviadenovírusokkal (“II. csoport”).

A béka-adenovírus és a THEV közös csoportja olyan filogenetikai távolságra van a másik három (elfogadott illetve javasolt) genustól, hogy egy negyedik adenovírus nemzetségnek tekintendõ. Javaslatunkat alátámasztja a jellegzetesen eltérõ genom-szervezõdés is, ugyanakkor a két tag genom-szervezõdése megegyezik. A mastadenovírusok E1A-régiójának helyén ezekben a vírusokban egy szialidáz- (neuroaminidáz-) gén-homológ található, ezért a nemzetség nevéül a Siadenovirus-t javasoltuk (Davison és Harrach, 2001).

 

Az atadenovírusok eredete

 

A béka-adenovírus jellemzésével nagy valószinûséggel kizártuk azt, hogy kétéltûek adenovírusaiból származnának az atadenovírusok. Megközelítõen azonos evolúciós távolságra levõ állatcsoportot keresve a halak és a hüllõk jöhettek szóba, melyekbõl az utóbbit valószinûsítettük (Harrach, 2000). Feltételezésünk helytállóságát jelenleg vizsgáljuk. Egy király pitonból és egy gabonasiklóból izolált adenovírus genom-szakaszait szekvenálva, elõzetes filogenetikai elemzéseink egyelõre megerõsítik, hogy mindkét hüllõ-adenovírus atadenovírus, sõt, e genus jellegzetességét, a p32K-gént is megtaláltuk. Megjegyzem, hogy munkatársaim hal-adenovírus szekvenálásával kapott eredményei az atadenovírusok hal-eredetét viszont kizárják. A fehér tokból izolált adenovírus DNS-szekvenciájának elemzése arra utal, hogy a hal-adenovírusok egy újabb genust alkotnak. Pillanatnyilag úgy tûnik, hogy talán minden gerinces osztály adenovírusát külön nemzetségbe kell majd besorolni.

Az eltelt (százmillió?) évek alatt egymástól a “faj-korláttal” elválasztva függetlenül fejlõdött vírusoknál jelentõs mértékben eltérõ genom-szervezõdés alakult ki. Genetikai különbözõségük az egyedi gének filogenetikai elemzésével könnyen mérhetõ. A megértést a korábban fel nem ismert gazdaváltások nehezítették (kétéltûbõl pulykába; hüllõbõl kacsába, [õs-] kérõdzõbe, erszényesrókába).

Bár a molekuláris evolúciós események pontos idõrendiségének számításos megállapítását több tényezõ nehezíti (pl. a gének evolúciójának eltérõ sebessége, a molekuláris órát alkalmazó számítógépes programok megbízhatatlansága), az adenovírusok és gazdaállataik együttes evolúciója alapján kísérletet tehetünk a ma létezõ adenovírus nemzetségek elkülönülésének idõpontjának megbecslésére. Feltételezve, hogy a tokból izolált adenovírus végig a “csontos halakkal”, pontosabban a sugarasúszójú halakkal (Actinopterygii) fejlõdött, a béka-adenovírus, kígyó-adenovírus, vagy a tipikus emlõs- és madár-adenovírusok pedig ezekkel a származási vonalakkal, akkor feltételezhetjük, hogy adenovírusok legalább 450 millió éve léteznek (sugarasúszójú halak kialakulása; Kumar and Hedges, 1998), a siadenovírusok (csupasztestû kétéltûek, Lissamphibia) kb. 360 millió éve különültek el, a mastadenovírusok pedig 310 millió éve (Synapsida [emlõsök] és Diapsida [“hüllõk” és madarak] szétválása). Hasonló feltételezés alapján az atadenovírusok 276 millió éve fejlõdhetnek függetlenül, mert a Lepidosauria alosztály (hidasgyíkok, pikkelyes hüllõk) 276 millió éve különült el a molekuláris számítások szerint (Kumar and Hedges, 1998), az aviadenovírusok pedig 222 millió éve (a madarak és krokodilok egymástól való elkülönülésének becsült ideje). Természetesen, ma még nem tudjuk, hogy a krokodil- (vagy teknõs-) adenovírusok melyik adenovírus genus tagjaihoz lesznek majd hasonlók. Az adenovírusok ennél régebbi elõfordulására (adenovírus leírása õsibb állatfajban) még nincs adat. Bár a PRD1 baktérium-fágban hexon- és pentonszerû fehérjét valamint ITR-szerû genomvég-ismétlõdést véltek felfedezni (Benson et al., 1999), ami az adenovírusok bakteriális eredetére is utalhat, kellõ hasonlóságú DNS-szekvenciák hiányában mi nem tudtuk vizsgálni ezt a kérdést.

 

Egyes szerotípusok eredete

 

A BAdV-2 valójában ovin eredetû

 

Filogenetikai számításaink azt mutatják, hogy a BAdV-2 nagyon közeli rokona a juh-adenovírus 2–5 szerotípusoknak, és közelebb áll ezekhez, mint más BAdV-okhoz. Ezzel szemben az 1-es szerotípusú juh-adenovírus távolabb áll e csoporttól. A korábbi klasszikus virológiai vizsgálatok eredményei, melyek szerint a BAdV-2 juhokban is nagyon gyakori (Belák és Pálfi, 1974; Belák et al., 1986; Rusvai és Fodor, 1998) kézenfekvõ a következtetés, hogy ez a vírus eredetileg juh adenovírus volt. Feltehetõleg késõbb adaptálódott szarvasmarhához, és véletlenül elsõ izolálása is ebbõl a fajból történt.

 

Az OAV287 esetleg kecske-eredetû

 

Az OAV287 genomjának leírása (egyszerûen “juh-adenovírusként” említve), amikor más juh-adenovírusból még egyáltalán nem volt ismert DNS-szekvencia, kissé félrevezetõ hatással járt. Sokakban azt a képzetet keltette, hogy minden juh-AdV izolátum atadenovírus. Valójában a helyzet éppen fordított, öt elismert és tanulmányozott OAdV tipikus mastadenovírus. A DNS-szekvenciák hiánya miatt elkezdtük az OAdV-ok szekvenálását és filogenetikai elemzését (Barbezange et al., 2000). Hosszabb-rövidebb szekvenciát nyertünk mind az öt említett szerotípusból és a filogenetikai analízis bizonyította ezeknek a mastadenovírusokhoz való tartozását. Megerõsítettük a DNS-hibridizációs eredményeken alapuló korábbi feltételezéseket, hogy az OAdV-1 elkülönül az egymáshoz nagyon hasonlító OAdV-2–5 és BAdV-2-tõl.

            Honnan származhat az ausztrál OAV287 izolátum, miért nem találtak eddig hozzá hasonlót Európában? A nemrég közölt kecske-adenovírus DNS-szekvenciájának (Lehmkuhl et al., 1999) filogenetikai analízise az OAV287-tel való közeli rokonságra utal (1. ábra). Elképzelhetõ tehát, hogy az eredeti gazda esetleg kecske, amelynek adenovírusait eddig kevésbé vizsgálták.

 

Majom-eredetû HAdV-ok?

 

A majom-adenovírusok további jó példát szolgáltatnak arra, hogy egy vírus jelenlegi gazda-spektruma nem minden esetben döntő a vírus jellemzése szempontjából. Filogenetikai számításaink az elérhető (kevésbé megbízható, rövid) VA-RNS-génre (Kidd et al., 1995), néha a hexonra és néhány részleges egyéb gén-szekvenciára támaszkodva azt mutatják, hogy egyes simian adenovírusok (SAdV) sokkal közelebb állnak bizonyos HAdV-okhoz, mint a HAdV-ok egymáshoz (1. ábra). Úgy tûnik, hogy az ismert öt csimpánz-adenovírusból a SAdV-21 a HAdV-ok B csoportjába, a SAdV-22–25 az E csoportba tartozik. Mivel az 51 ismert HAdV közül csupán egyetlen tartozik az utóbbi csoportba (HAdV-4), ezért lehetséges, hogy a csimpánzokkal együtt fejlődött csoportról van szó, amelynek egyetlen tagja megjelent az emberben is. A főemlősök adenovírusainak időnkénti gazdacseréjére látszólag mindkét irányban van lehetőség. A fenti elmélkedést folytatva, a népes HAdV B csoportban megjelenő egyetlen csimpánz-adenovírus (SAdV-21) humán eredetűnek vélhető. (A nagyon változékony E3-régió megőrzöttsége az említett csoportokon belül szintén mutatja e csoportosítások helytállóságát.) Mindezek alapján jogos, hogy a gazdaeredet csak egy a speciest meghatározó kritériumok között (lásd késõbb).

 

Az Adenoviridae család molekuláris evolúciójának lehetséges irányai,
közös származott tulajdonságok

 

Az adenovírusok genom-variációit tekintve adódik a kérdés a fejlõdés irányára vonatkozóan, hogy az evolúció során rövidül vagy nõ-e a genom hossza. Amennyiben elfogadjuk, hogy a hidegvérû gerincesek eddig vizsgált adenovírusai hûen tükrözik a többi oda tartozó vírus tulajdonságait, néhány tanulság levonható.

Az eddig megismert legõsibb AdV- (a béka-adenovírus-) genom a legrövidebb, ezt a másik kétéltû-eredetûnek feltételezett AdV (pulyka-adenovírus 3) genomja követi, majd a hüllõ-eredetûnek gondolt atadenovírusok. Ez arra a logikus lehetõségre utal, hogy az õs-adenovírus genomja rövid volt, a replikációhoz szükséges minimális információt hordozta. Az evolúció során a vírusgenom fokozatosan nõtt és környezetébõl, pl. a gerinces állatok kromoszómáiból vett fel egyre újabb DNS-szakaszokat. Jó példa erre a dUTPáz-enzim génje, ami a tyúk-adenovírusok mellett néhány emlõs-adenovírusban is felbukkan. Összehasonlítva az avi- és mastadenovírusok, valamint a gerincesek dUTPáz-génjeit kiviláglik, hogy az adenovírusok két genusában elõforduló gének nem hasonlítanak jobban egymásra, mint a gerincesekben fellelhetõk (tehát feltehetõleg az AdV-dUTPáz-gének nem egymásból fejlõdtek ki lassú evolúcióval). A két genus (egyes) vírusai legalább két különbözõ idõpontban vették fel e gént (esetleg akár annak duplikációból eredõ különbözõ változatait). Ha ez az esemény a két vírus-genus szétválása elõtt történt volna, akkor feltehetõen az összes mastadenovírus genomban benne lenne a gén. A siadenovírusok szialidáz-génjéhez nagyon hasonló gén elõfordul baktériumokban és eukaryotákban (így gerinces állatokban) is, de a virális gén származása bizonytalan.

Más korai gének eredetét még nem ismerjük, vagy csak feltevéseink vannak, de jellemzõ, hogy a vírus ezeket a szaporodását, túlélését segítõ géneket az evolúció során megõrzi. A vírus-genuson vagy annak kisebb csoportjain belül megõrzött, közös származott tulajdonságok segítik a vírusok csoportosítását is. Így eddig minden mastadenovírusban találtak E1A és B régiót a genom bal végén. Ugyanott, minden aviadenovírusban dUTPáz-gént, az atadenovírusokban p32K-gént, a siadenovírusokban szialidáz-homológ-gént látunk. Más genushoz tartozó adenovírusban viszont nem fordulnak elõ ezek a gének. (A néhány mastadenovírus által feltehetõleg függetlenül felvett dUTPáz-gén a genom ellenkezõ végén található.) Ugyanígy minden mastadenovírusban van protein V- és IX-gén, E3- és E4-régió, de ezek hiányoznak minden más AdV genomjából. (A siadenovírusban az E3 helyén talált gén, vagy az atadenovírusokban az E4 helyén található gének, nem homológok a mastadenovírusok génjeivel.) Úgy tûnik, hogy a “vírussal összefüggõ RNS” (“virus associated RNA”, VA-RNS) gén csak a fõemlõsök adenovírusaiban fordul elõ. (A hasonló néven leírt tyúk-adenovírus VA-RNS nem mutat semmilyen homológiát ezekkel.)

Az adenovírusok fordított vég-ismétlõdéseinek (“inverted terminal repeat”, ITR) hossza is jellegzetes. Természetesen ezek összehasonlításakor el kell tekintenünk az ITR-nél leírt ismétlõdésektõl (Fejér et al., 1992). Az ITR legrövidebb a béka-adenovírusnál (36 bp) és a THEV-nél (39 bp). Alig hosszabb az atadenovírusok és aviadenovírusok ITR-je: 46-74 bp (Dán et al., 2001). A mastadenovírusok viszont számtalan szabályozófehérje (NFI, NFIII, Sp1, ATF) kötõhelyet vettek fel feltételezhetõen a gazdáik kromoszómáiból, és ITR-jük mindig aránylag hosszú (93-368 bp). Az eddig talált leghosszabb ITR az általunk szekvenált BAdV-10-ben fordul elõ (Dán et al., 2001).

Eddigi koevolúciós feltételezéseinket elfogadva azt kell gondolnunk, hogy a legtöbb adenovírus fejlõdése pontosan követte gazdáik fejlõdését. Ahogy elkülönültek a halak, a kétéltûek, aztán az emlõsök, majd végül a hüllõk és madarak, úgy váltak külön evolúciós ágakra az adenovírusok is. Ettõl való eltérést csak a feltételezett gazdaváltások eredményeztek, a kétéltûekbõl és hüllõkbõl a madarakra és emlõsökre. Ha ez kellõen régen történt, akkor mára már az új gazdában is több vírustípus alakult ki, mint pl. a kérõdzõknél, akár egyetlen fajon, a szarvasmarhán belül is (BAdV-4–8).

 


Taxonómiai problémák

 

A korszerû vírus taxonómiától is elvárható, hogy lehetõleg az evolúció történéseit tükrözze, és ne mereven támaszkodjon olyan, néha félrevezetõ, kritériumokra, mint pl. az elsõként megismert vagy jelenlegi gazdafaj. Filogenetikai számításaink megteremtették a lehetõséget, hogy pontos, bárki által megismételhetõ számításokra alapozott rendszertani beosztásokra tegyünk javaslatokat az Adenoviridae család esetén. Eddigi ismereteink alapján legalább öt adenovírus nemzetséget kell elkülöníteni (még a gazdákra alapozva is, ha mindig az eredeti gazdából indulunk ki). Ezek konkrét elnevezése már kevésbé tudományos kérdés. Mindesetre a mast- és aviadenovírus elnevezés annyiban továbbra is helyes, hogy minden oda tartozó vírusra érvényes (pl. minden mastadenovírust emlõsbõl izoláltak). Ugyanakkor emlõs- és madárfajokból izoláltak egyértelmûen más genushoz tartozó AdV-ket is. A halak adenovírusait lehetne pl. Ichtadenovirus nemzetségnek nevezni, mert ilyen vírusokat eddig más állatfajban nem találtak. Problémásabb a helyzet azoknál az adenovírusoknál, amelyek több gerinces-osztály fajaiban is elõfordulnak. Lehetõleg olyan elnevezést kellene választani, ami az összes tagra jellemzõ tulajdonságra utal. Az eddig összesen két tagot számláló Siadenovirus nemzetség elnevezése egyelõre helyes.

 

A vírus species

 

Az ICTV 2000-ben megjelent Hetedik Jelentésének szerkesztői követelményként kötötték ki a species (vírusfaj) fogalmának pontos meghatározását minden vírus-család esetében. Az adenovírusoknál évekig csak a szerotípusokat tartották számon, mivel ez pontosan definiálható volt a neutralizációs próbában megfigyelt keresztreakciók hiánya, illetve számszerű mértéke szerint. Nem pontosan tisztázott alapon egyes kutatók a típusokat nevezték speciesnek, holott ezzel kapcsolatban végleges megállapodás feltehetőleg nem volt. Köztudott azonban, hogy a szerológiai alapon két külön típusba sorolt HAdV-2 és 5 DNS sorrendje 98%-ban megegyezik, más típusok nukleotid-sorrendjétől viszont jelentősen eltér. A minden egyes típus egy species elv nem szolgáltatott semmi többlet információt az egyes típusok egymáshoz viszonyított rokonságának fokára vonatkozóan. Új koncepciót dolgoztunk ki, melynek alapjául a HAdV-ok csoport (subgenus) beosztását találtuk alkalmasnak. A különböző biológiai és szerológiai (hemagglutinációs) tulajdonságok alapján korábban felállított hat csoport (A–F) lett a hat HAdV-species. Ezt a meglehetősen régi csoportosítást ugyanis filogenetikai számításaink is megerősítették. A tyúk-adenovírusok (FAdV) esetében hasonló csoportosítást állított fel Zsák és Kisary (1984) a vírus DNS RE mintázata alapján, melyet DNS-szekvenálással és filogenetikai számításokkal megerõsítettünk (Papp et al., 2001). Mivel az öt FAdV csoportot is betűkkel jelölték, a specieseknek is a gazdafaj–betű elnevezést ajánlottuk (Harrach, 2001). A rendelkezésre álló szekvenciák filogenetikai analízisének eredménye alapján megkíséreltük az eddig ismert állati eredetű típusok speciesbe sorolását (Benkõ et al., 2000). Természetesen néhány olyan vírusfajt is ki kellett alakítani, amelynek egyelőre csak egy típus a képviselője.

A vírusfaj, mint rendszertani egység a meghatározás szerint ún. polythetikus kategória, azaz nincs egyetlen olyan tulajdonság sem, amellyel feltétlenül rendelkeznie kell a kategóriába sorolandó minden egyednek. Ugyanakkor, általában a vírusfajnak nincs egyetlen olyan képviselője sem, amelyre valamennyi kritérium érvényes lenne. A gyakorlatban tehát a vírusfajba sorolás feltételeit érdemes úgy megválasztani, hogy azok közül néhánynak a megléte meghatározza a besorolást. Az adenovírusok esetében javaslatot dolgoztunk ki, de a rendelkezésünkre álló idő rövidsége miatt nem sikerült széleskörű megvitatásra bocsátani. Az első lépést azonban megtettük, és jelenleg gyűjtjük az adenovirológusok véleményét, ötleteit, javaslatait. Az ICTV Hetedik Jelentésében az alábbi kritériumok szerepelnek: gazda-eredet, meghatározott mértékű egy vagy kétirányú keresztreakció vírus-neutralizációs próbában, DNS-hibridizáció, RE mintázat hasonlósága, azonos méretű fragmentumok száma, rekombinációs képesség, hemagglutinációs tulajdonságok, százalékos GC-tartalom, filogenetikai távolság meghatározott mértéke, stb. (Benkõ et al., 2000).

Néhány meglepõ közös fajba sorolás: BAdV-2 és OAdV-2–5 (GC%, gazda, filogenetikai számítás); bizonyos majom- és humán adenovírusok (hemagglutinácó, keresztneutralizáció, szekvencia-adatok); OAV287 és az 1-es szerotípusú kecske-adenovírus. Mivel a kutya-adenovírusokat számos, a Ragadozók rendjéhez tartozó fajból izolálták már (pl. medve, róka, stb.), ezért vírusfaj névnek az általánosabb Carnivore adenovirus nevet javasoljuk. Hasonlóképpen a majom- és humán adenovírusfajok mindkettõre jellemzõ neve a Primate adenovirus A–F lenne, a kérõdzõké pedig Ruminant adenovirus, mivel a bovin és ovin izolátumok mellett egyre nõ a különbözõ szarvas-fajokból, bivalyból, házi és vadkecskébõl izolált törzsek száma. Bizonyítékaink vannak a keresztfertõzésekre is, pl. dámszarvasban BAdV-6 fordult elõ (Boros et al., 1985). A vírusfajok (és neveik) pontosítása folyamatosan zajlik a nyert szekvenciák tanulmányozásával. A jelenleg aktuális javaslat az alábbi.

 

Mastadenovírus genus                                         Aviadenovírus genus (jellemzõ törzs)

 

Carnivore adenovirus [CAdV-1, 2]                            Fowl adenovirus A [FAdV-1] (CELO)

Equine adenovirus A [EAdV-1]                                                         B [FAdV-5] (TR22)

     B [EAdV-2]                                                   C [FAdV-4 10] (KR-5, CFA20)

Guinea pig adenovirus [GPAdV-1]                                                    D [FAdV-2, 3, 9, 11]

Murine adenovirus A [MAdV-1]                                                              (685, SR49, A2, 380)

Porcine adenovirus A [PAdV-1–3]                                                     E [FAdV-6–8] (168, X-11, TR59)

      B [PAdV-4]                             Goose adenovirus [GoAdV-1–3]

      C [PAdV-5]                                               

Primate adenovirus A [HAdV-12, 18, 31;                  Feltételezett species a genusban

                                 SAdV-2–4, 6, 9, 10, 11, 14;   Duck adenovirus B [DAdV-2]

                                 csimpánz AdV Y34]              Pigeon adenovirus [PiAdV-1]

     B [HAdV-3, 7, 11, 14, 16, 21,     Turkey adenovirus B [TAdV-1, 2]

          34, 35, 50; SAdV-21]          

     C [HAdV-1, 2, 5, 6; BAdV-9;      Atadenovirus genus

         SAdV-13, 26?/C2]                

     D [HAdV-8, 9, 10, 13, 15, 17,     Duck adenovirus [DAdV-1 (EDS-vírus)]

         19, 20, 22–30, 32, 33,           Marsupial adenovirus [PoAdV-1]

         36–39, 42–49, 51]                 Ruminant atadenovirus A [BAdV-4–6, 8]

     E [HAdV-4; SAdV-22–25]                                            B [BAdV-7]

     F [HAdV-40, 41; SAdV-16, 19]                                     C [OAdV-7 (OAV287),

Ruminant adenovirus A [BAdV-1]                                                                    GadV-1]

         B [BAdV-3]                                                              D [OdAdV-1]

         C [BAdV-10]                         Snake adenovirus [SnAdV-1]

         D [OAdV-1]                                            

         E [OAdV-2–5; BAdV-2]         Feltételezett species a genusban

         F [GAdV-2]                          Ruminant atadenovirus E [OAdV-6]

Tree shrew adenovirus [TSAdV-1]                          

                                                                            Siadenovirus genus

Feltételezett species a genusban                       

Murine adenovirus B [MAdV-2]                                Frog adenovirus [FrAdV-1]

Simian adenovirus [SAdV-1, 5, 7, 8, 12, 15, 17,       Turkey adenovirus A [TAdV-3 (THEV, MSDV)]

    18, 20, 27?]                              

 


GenBank-káosz – a javított és normalizált on-line adatbázisunk

 

Munkánk során, fõleg kezdetben komoly gyakorlati problémát jelentett, hogy a különbözõ kutatók által a szekvencia-adatbázisokba benyújtott adatok nevezéktani hibáinak kiszûrésére nincs hatékony és automatikus mechanizmus. Egy kirívó példa a tengerimalac-AdV, ami a GenBank szerint egy nem azonosított sertés-AdV. Egy másik példa, a penton-gén a FAdV-10-bõl, amit ”Mastadenovirus fowl10” névvel jelölnek. További probléma, hogy ha a kutatók nem nyújtják be a kódolt fehérjék aminosav-szekvenciáját is, akkor azok hiányoznak a fehérje-adatbázisból, és a homológia keresõ programok nem találhatják meg, mégha egy vírus egész genomja ismert is. Erõfeszítéseket tettünk ezért a mások által benyújtott adenovírus-adatokban talált hibák kijavítására. Egyrészt saját adatbázist készítettünk a javított adatokkal (http://www.vmri.hu/~harrach/ADENO1.htm). Felállítottunk egy interneten elérhetõ homológia keresõ programot is a jelenleg leghatékonyabb ilyen program, a Blast-programcsomag felhasználásával, ami saját adatainkkal összehasonlítva vizsgálja a beküldött szekvenciát (http://www.vmri.hu/blast.htm). Másrészt az amerikai GenBank illetékeseivel elfogadtattuk javaslataink többségét. Ezzel már az ICTV hivatalos (lassú és bürokratikus) jóváhagyása elõtt sikerült a négy genusos adenovírus-beosztás gyakorlati alkalmazását bevezetni. Végül elhelyeztünk az interneten egy összefoglaló táblázatot, aminek segítségével azonnal megállapítható, hogy melyik adenovírusból milyen DNS-szekvencia ismert, és ezek közvetlenül el is érhetõk (http://www.vmri.hu/~harrach/ADENOSEQ.HTM). Hasonlóan lehívható innen a fontosabb fehérjék szekvencia-illesztése, valamint az azokon alapuló törzsfejlõdési fák.

 

Összefoglalva munkámat úgy vélem, hogy számos állati adenovírus-genom DNS-szekvenciájának megismerése és filogenetikai elemzése utat nyitott az adenovírusok rokonsági viszonyainak és evolúciós múltjának felderítéséhez, és lehetõvé tette egy korszerû taxonómia alapjainak kialakítását.

 


 

LEGFONTOSABB EREDMÉNYEIM ÉS MEGÁLLAPÍTÁSAIM

 

1.        Filogenetikai számításokkal bizonyítottam, hogy a 2. alcsoportbeli bovin adenovírusok evolúciós szempontból legalább olyan távol esnek a mastadenovírusoktól, mint az aviadenovírusok.

2.        Elsõként állapítottuk meg, hogy az 1-es szerotípusú kacsa-adenovírus (EDS-vírus) és a 2. alcsoportbeli bovin adenovírusok közeli rokonságban állnak.

3.        Több BAdV-genom vizsgálata során a genom-szervezõdésben olyan jelleg-zetességeket tártunk fel, melyek alapján javaslatot tettünk egy új (harmadik) nemzetség felállítására az Adenoviridae családon belül (Atadenovírus).

4.        Megállapítottuk, hogy az erszényesróka adenovírusa is atadenovírus.

5.        A béka-adenovírus teljes genomjának analízisével megállapítottuk, hogy az legjobban egy pulyka-adenovírus (THEV) genomjához hasonlít. Javaslatot tettünk egy negyedik genus létrehozására e vírusok besorolásához.

6.        Felismerni vélem, hogy minden gerinces osztály saját (vele végig együtt fejlõdött) adenovírusát külön vírusnemzetségbe kellene besorolni.

7.        Kidolgoztunk egy új vírusfaj koncepciót (az adenovírus-szerotípusok csoportosítása), amit az ICTV elfogadott.

8.        A gazdafajok és vírusainak evolúciós fáját összehasonlítva hipotézist állítottam fel az adenovírusok törzsfejlõdésének irányára és az atadenovírusok hüllő-eredetére, amit a kígyó-adenovírus most folyó szekvenálása bizonyítani látszik.

9.        DNS-szekvenálás és/vagy filogenetikai számítások alapján úgy véljük, hogy a bovin adenovírus 2 juh-eredetű. A juhból izolált OAV287 jelû törzs kecskéből kerülhetett az új gazdára. A HAdV-4 pedig eredetileg csimpánz-vírus lehetett.

10.   Interneten elérhetõ (javított) szekvencia-adatbázist és erre alapított homológia kereső programot tettünk elérhetővé adataink és az általunk javasolt taxonómia megismertetésére és népszerûsítésére.


Idézett irodalom

 

Ádám É, Nász I, Lengyel A (1996) Characterization of adenovirus hexons by their epitope composition. Arch Virol 141:1891-1907

Ádám É, Rusvai M, Lengyel A, Belák S, Nász I (1988) Antigenic relationship between human and animal adenovirus hexons determined by means of monoclonal antibodies directed against bovine adenovirus type 2 hexon. Arch Virol 100:9-15

Barbezange C, Benkõ M, Dán Á, Harrach B (2000) DNA sequencing and phylogenetic analysis of the protease gene of ovine adenovirus 3 suggest that adenoviruses of sheep belong to two different genera. Virus Res 66:79-85 (teljes cikk)

Bartha A (1969) Proposal for subgrouping of bovine adenoviruses. Acta Vet Hung 19:319-321

Belák S, Berencsi Gy, Rusvai M, Lukács K, Nász I (1983) DNA structure, and hemagglutination properties of bovine adenovirus type 2 strains which bypass species specificity. Arch Virol 77:181-194

Belák S, Pálfi V (1974) An adenovirus isolated from sheep and its relationship to type 2 bovine adenovirus. Arch Ges Virusforsch 46:366-369

Belák S, Virtanen A, Zabielski J, Rusvai M, Berencsi Gy, Pettersson U (1986) Subtypes of bovine adenovirus type 2 exhibit major differences in region E3. Virology 153:262-271

Benkõ M, Bartha A, Wadell G (1988) DNA restriction enzyme analysis of bovine adenoviruses. Intervirol 29:346-350

Benkõ M, Dán Á, Bánrévi A, Harrach B (2001) Analysis of the complete genome sequence of bovine adenovirus type 4 confirms the characteristic features of the members of the new genus Atadenovirus. GenBank Accession number AF036092

Benkõ M, Harrach B (1990) Restriction site mapping of bovine adenovirus type 1. Acta Vet Hung 38:281-284

Benkõ M, Harrach B (1994) Identification of the proteinase gene of bovine adenovirus type 4. Acta Microbiol Immunol Hung 41:323

Benkõ M, Harrach B (1998) A proposal for establishing a new (third) genus within the Adenoviridae family. Arch Virol 143:829-837

Benkõ M, Harrach B, DHalluin JC (1990) Molecular cloning and physical mapping of the DNA of bovine adenovirus serotype 4 study of the DNA homology among bovine, human and porcine adenoviruses. J Gen Virol 71:465-469

Benkõ M, Harrach B, Russell WC (2000): Family Adenoviridae. van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB (szerk) Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, pp. 227-238

Benson SD, Bamford JK, Bamford DH, Burnett RM (1999) Viral evolution revealed by bacteriophage PRD1 and human adenovirus coat protein structures. Cell. 98:825-833

Boros G, Gráf Z, Benkõ M, Bartha A (1985) Isolation of a bovine adenovirus from fallow deer (Dama dama). Acta Vet Hung 33:119-123

Chiocca S, Kurzbauer R, Schaffner G, Baker A, Mautner V, Cotten M. (1996) The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. J Virol 70:2939-2949 (teljes cikk)

Dán Á, Benkõ M, Zádori Z, Bánrévi A, Ursu K, Harrach B (1997) Unusual genome organization of bovine adenovirus type 4. Acta Microbiol Immunol Hung 44:34

Dán Á, Élõ P, Harrach B, Zádori Z, Benkõ M (2001) Four new inverted terminal repeat sequences from bovine adenoviruses reveal striking differences in the length and content of the ITRs. Virus Genes 22:175-179

Dán Á, Ruzsics Zs, Russell WC, Benkõ M., Harrach B (1998) Analysis of the hexon gene sequence of bovine adenovirus type 4 provides further support for a new adenovirus genus (Atadenovirus). J Gen Virol 79:1453-1460 (teljes cikk)

Davison A, Harrach B (2001) Genus Siadenovirus. Tidona CA, Darai G (szerk) The Springer Index of Viruses, Springer-Verlag, Heidelberg (nyomdában)

Davison AJ, Wright KM, Harrach B (2000) DNA sequence of frog adenovirus. J Gen Virol 81:2431-2439 (teljes cikk)

Evans PS, Benkõ M, Harrach B, Letchworth GJ (1998) Sequence, transcriptional analysis and deletion of the bovine adenovirus type 1 E3 region. Virology 244:173-185

Fejér Gy, Berencsi Gy, Ruzsics Zs, Belák S, Linne T, Nász I (1992) Multiple enlargements in the right inverted terminal repeat of the DNA of canine adenovirus type 2. Acta Microbiol Hung 39:159-168

Harrach B (1998) Biotechnológia az állategészségügyben. Dudits D, Dohy J (szerk) Biotechnológia: lépéstartás Európával. (Magyarország az ezredfordulón. Stratégiai kutatások a Magyar Tudományos Akadémián. II. Az agrárium helyzete és jövõje) Magyar Tudományos Akadémia, Budapest pp. 121-155

Harrach B (2000) Reptile adenoviruses in cattle? Acta Vet Hung 48.485–490

Harrach B (2001) Genus Aviadenovirus. Tidona CA, Darai G (szerk) The Springer Index of Viruses. Springer-Verlag, Heidelberg (nyomdában)

Harrach B, Benkõ M (1990) Alternating one-letter symbols for the representation of codon variations at the level of amino acid sequences. Acta Vet Hung 38:285-286

Harrach B, Benkõ M (1998a) Phyogenetic analysis of adenovirus sequences; proof of necessity of establishing a third genus in the Adenoviridae family. Wold WSM (szerk) Adenovirus Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol. 21) Humana Press, Totowa, NJ, USA pp 309-339

Harrach B, Benkõ M (1998b) Miért provokálnak vitát még ma is az Áldásy által több mint 30 éve izolált adenovírusok? Magy Állatorv Lapja 120:650-651

Harrach B, Evans P, Rusvai M, Bánrévi A, Berencsi Gy, Benkõ M (1996) DNA sequencing and phylogenetic analysis of bovine adenovirus types 1, 2, 3, 4, 7, 9, and 10 justify the existence of two subgroups. Acta Microbiol Immunol Hung 43:206

Harrach B, Meehan BM, Benkõ M, Adair BM, Todd D (1997) Close phylogenetic relationship between egg drop syndrome virus, bovine adenovirus serotype 7, and ovine adenovirus strain 287. Virology 229:302-306

Hess M, Blöcker H, Brandt P (1997) The complete nucleotide sequence of the egg drop syndrome virus: an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses. Virology 238:145-156

Izadpanah R, Benkõ M, Ursu K, Dán Á, Rusvai M, Harrach B (2001) Characterisation of the fiber gene and partial sequence of the early region 4 of bovine adenovirus 2. Acta Vet Hung 49: 245-253

Kidd AH, Garwicz D, Öberg M (1995) Human and simian adenoviruses: phylogenetic inferences from analysis of VA RNA genes. Virology 207:32-45

Kiss I, Matiz K, Allard A, Wadell G, Benkõ M (1996a) Detection of homologous DNA sequences in animal adenoviruses by polymerase chain reaction. Acta Vet Hung 44:243-251

Kiss I, Matiz K, Bajmóci E, Rusvai M, Harrach B (1996b) Infectious canine hepatitis: detection of canine adenovirus type 1 by polymerase chain reaction. Acta Vet Hung 44:253-258

Kumar S, Hedges SB (1998) A molecular timescale for vertebrate evolution. Nature 392:917-920

Lakatos B, Farkas J, Egberink HF, Vennema H, Horzinek MC, Benkõ M (1999) Detection of adenovirus hexon sequence in a cat by polymerase chain reaction. Acta Vet Hung 47:493-497

Lehmkuhl HD, Cutlip RC (1999) A new goat adenovirus isolate proposed as the prototype strain for goat adenovirus serotype 1. Arch Virol 144:1611-1618

Maidak BL, Olsen GJ, Larsen N, Overbeek R, McCaughey MJ, Woese CR (1997) The RDP (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res 25:109-111

Matiz K, Benkõ M, Zádori Z, Harrach B (1996) Restriction site mapping of a bovine adenovirus type 10 strain. Acta Vet Hung 44:389-394

Matiz K, Ursu K, Harrach B, Zádori Z, Benkõ M (1998) Sequencing and phylogenetic analysis of the protease gene, and genetic mapping of bovine adenovirus type 10 define its relatedness to other bovine adenoviruses. Virus Res 55:29-35 (teljes cikk)

Ojkic D, Nagy É (2000) The complete nucleotide sequence of fowl adenovirus type 8. J Gen Virol 81:1833-1837 (teljes cikk)

Papp T, Dán Á, Palya V, Révész T, Ivanics É, Glávits R, Sági E, Harrach B (2001) Study of fowl adenoviruses by PCR and DNA sequencing. Acta Microbiol Immunol Hung 48:263-264

Rusvai M, Fodor L (1998) Occurrence of some viruses and bacteria involved in respiratory diseases of ruminants in Hungary. Acta Vet Hung 46:405-414

Rusvai M, Harrach B, Bánrévi A, Evans PS, Benkõ M (2000) Identification and sequence analysis of the core protein genes of bovine adenovirus 2. Virus Res 70:25-30
(teljes cikk)

Shinagawa M, Matsuda A, Ishiyama T, Goto H, Sato G (1983) A rapid and simple method for preparation of adenovirus DNA from infected cells. Microbiol Immunol 27:817-822

Smyth JA, Benkõ M, Moffett DA, Harrach B (1996) Bovine adenovirus type 10 identified in fatal cases of adenovirus-associated enteric disease in cattle by in situ hybridization. J Clin Microbiol 34:1270-1274 (teljes cikk)

Szathmáry R, Barbezange C, Dán Á, Harrach B. (1997) Simultaneous physical and genetic mapping of viruses: cloning, sequencing, and mapping of the genome of bovine adenovirus type 6. NADC First Int Virtual Conf Infectious Dis Animals. ápr 20-máj 2, NADC Ames, Iowa, B00011

Thomson D, Meers J, Harrach B (2002) Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail possums (Trichosurus vulpecula). Virus Res 83:189-195 (teljes cikk)

Tuboly T, Nagy É (2001) Construction and characterization of recombinant porcine adenovirus serotype 5 expressing the transmissible gastroenteritis virus spike gene. J Gen Virol 82:183-190 (teljes cikk)

Tuboly T, Nagy É, Derbyshire JB (1993) Potential viral vectors for the stimulation of mucosal antibody responses against enteric viral antigens in pigs. Res Vet Sci 54:345-350

Vrati S, Brookes DE, Strike P, Khatri A, Boyle DB, Both GW (1996) Unique genome arrangement of an ovine adenovirus: identification of new proteins and proteinase cleavage sites. Virology 220:186-199

Wigand R, Bartha A, Dreizin RS, Esche H, Ginsberg HS, Green M, Hierholzer JC, Kalter SS, McFerran JB, Petterson U, Russell WC, Wadell G (1982) Adenoviridae: second report. Intervirol 18:169-176

Zakharchuk AN, Kruglyak VA, Akopian TA, Naroditsky BS, Tikchonenko TI (1993) Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA. Arch Virol 128:171-176

Zsák L, Kisary J (1984) Grouping of fowl adenoviruses based upon the restriction patterns of DNA generated by BamHI and HindIII. Intervirology 22:110-114.

 


A TÉZISEK ALAPJÁT KÉPEZÕ KÖZLEMÉNYEK

 

1. Harrach B, Meehan BM, Benkõ M, Adair BM, Todd D (l997): Close phylogenetic relationship between egg drop syndrome virus, bovine adenovirus serotype 7, and ovine adenovirus strain 287. Virology 229. 302-306.

2. Dán Á, Ruzsics Zs, Russell WC, Benkõ M, Harrach B (1998): Analysis of the hexon gene sequence of bovine adenovirus type 4 provides further support for a new adenovirus genus (Atadenovirus). J Gen Virol 1453-1460 (teljes cikk)

3. Harrach B, Benkõ M (1998): Phylogenetic analysis of adenovirus sequences; proof of the necessity of establishing a third genus in the Adenoviridae family. In Wold WSM (szerk.): Adenovirus Methods and Protocols. Methods in Molecular Medicine. Humana Press, Totowa, NJ, USA, pp. 309-339.

4. Benkõ M, Harrach B, Russell WC (2000): Family Adenoviridae. van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB (szerk.): Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, pp. 227-238.

5. Barbezange CM, Benkõ Á, Dán B, Harrach B (2000): DNA sequencing and phylogenetic analysis of the protease gene of ovine adenovirus 3 suggest that adenoviruses of sheep belong to two different genera. Virus Res 66. 79-85. (teljes cikk)

6. Davison AJ, Wright KM, Harrach B (2000): DNA sequence of frog adenovirus. J Gen Virol 81. 2431-2439 (teljes cikk)

7. Harrach B (2000): Reptile adenoviruses in cattle? Acta Vet Hung 48. 485–490.

8. Dán Á, Élõ P, Harrach B, Zádori Z, Benkõ M (2001): Four new inverted terminal repeat sequences from bovine adenoviruses reveal striking differences in the length and content of the ITRs. Virus Genes 22. 175-179

9 Davison A, Harrach B (2002): Genus Siadenovirus. In Tidona CA, Darai G (szerk.) The Springer Index of Viruses, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 29-33

10. Harrach B (2002): Genus Aviadenovirus. Tidona CA, Darai G (szerk.) The Springer Index of Viruses. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 9-18

11. Thompson D, Meers J, Harrach B, (2002): Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail possums (Trichosurus vulpecula). Virus Res 83:189-195 (teljes cikk)

 

 

 

 

EGYÉB KIEGÉSZÍTŐ INFORMÁCIÓK

 

Harrach B. cikkei a Medline adatbázisban
 

 

Harrach B. cikkei az Agricola adatbázisban