Bevezetés Anyag és módszer Eredmények Megbeszélés
Legfontosabb eredményeim és megállapításaim Irodalom
A tézisek alapját képezõ közlemények
MTA DOKTORI TÉZISEK
az adenovírusok
filogenetikája
Harrach
Balázs
Budapest
2001
[ugrási
lehetõség az idézett cikkek adataihoz, majd onnan az összefoglalóikhoz
vagy teljes szövegükhöz, a DNS- és aminosav-szekvenciákhoz, a
szekvencia-illesztésekhez, a nexus-formátumú (tetszõlegesen
megjeleníthetõ) és grafikusan megjelenített “evolúciós” fákhoz,
háromdimenziós (mozgatható) fehérje-képekhez, a felhasznált (letölthetõ)
számítógép-programokhoz]
Téziseimben
azokat a számítógépes filogenetikai analízisen alapuló összehasonlító
molekuláris virológiai munkáinkat és evolúciós következtetéseimet foglaltam
össze, amelyek alapját képezték az Adenoviridae
család rendszertanának gyökeres megújítását célzó javaslatainknak.
Az adenovírusok régóta és alaposan
tanulmányozott vírusok, a vizsgált típusok kiválasztása azonban a legutóbbi
idõkig meglehetõsen egyoldalú volt. Amíg az ember és a
gazdaságilag fontos háziállatok könnyen szaporítható adenovírusairól számos
molekuláris biológiai szintû adat gyûlt össze, addig az egzotikus
(pl. alacsonyabbrendû gerinces) állatok adenovírusairól, illetve a
nehezen szaporítható típusokról máig is keveset tudunk. A hivatalos rendszertan
jelenleg is csak a Mastadeno- és Aviadenovirus genust ismeri el, noha
adenovírusok jelenlétét halakban, kétéltûekben és hüllõkben is leírták,
és ezek nyilvánvalóan nem tartozhatnak az emlõs- vagy
madár-adenovírusokhoz.
Amikor immár több mint tíz évvel
ezelõtt az adenovírus kutatásba bekapcsolódtam, épp csak elindultak azok
a hazai kutatási pályázatok és tudományos együttmûködések, amelyeknek
témája egy különleges víruscsoport, az úgynevezett 2. alcsoportba tartozó
szarvasmarha-adenovírusok molekuláris biológiai tanulmányozása volt.
Témaválasztásom nem véletlenszerû volt: a háziállatok adenovírusos
fertõzöttségének illetve megbetegedéseinek kutatása nagy hagyományokkal
rendelkezett Magyarországon mind az állategészségügyi intézetekben, mind az
Állatorvos-tudományi Egyetem Járványtani Tanszékén, mind pedig
kutatóintézetünkben. A hazai humán adenovírus (HAdV) kutatások ugyancsak magas
színvonalon és az állatorvosokkal gyümölcsözõ együttmûködésben
folytak (Belák et al., 1983; Ádám et
al., 1988). Méltán nevezték hazánkat “adenovírus-nagyhatalomnak”. Mint a
molekuláris virológia iránt érdeklõdõ magyar állatorvosnak
kézenfekvõ volt egy olyan állati adenovírus csoport, a bovin
adenovírusok (BAdV) 2. alcsoportja, részletes tanulmányozásába kezdenem,
melynek elsõ tagjait Magyarországon izolálták és írták le a világon
elõször. Különleges biológiai tulajdonságaik alapján Bartha professzor (1969) már szinte felfedezésükkel egyidõben
felismerte, hogy e vírusok taxonómiai megkülönböztetése indokolt lenne. Az
akkor nemrég megalakult Nemzetközi
Vírusrendszertani Bizottság (ICTV) azonban exakt bizonyítékok hiányában a
nemzetség-szintû átsorolást elnapolta, így csak a Mastadenovirus
nemzetségen belül különítették el a szarvasmarha adenovírusok 2. alcsoportját (Wigand et al., 1982).
Az adenovírusok közepes
méretû, buroknélküli, ikozaéder-alakú, dupla-szálú DNS-vírusok.
Legnagyobb mennyiségben elõforduló fehérjéjük, a kapszidot alkotó hexon,
típus-, csoport- és genus-specifikus immunreakciókért felelõs (Ádám et al., 1996). Az adenovírusok
jellegzetes elektronmikroszkópos képét a kapszid csúcsairól kinyúló
antennaszerû fehérjeképletek, a fiberek adják, amik a virion sejthez való
kapcsolódásában játszanak fontos szerepet, és meghatározzák a vírus
sejt-tropizmusát is. Az egyes izolátumokat vírus-neutralizációs próbák
eredménye alapján sorolták szerotípusokba, és a szerotípusokat sokáig a faj
(species) kategóriájaként tartották számon. A legtöbb adenovírus gazdaspektruma
szûk. Általában fiatal egyedekben alakítanak ki enyhe tünetekkel járó
felsõlégúti betegséget, de a tünetmentes, rendszerint perzisztens
fertõzés is gyakori. Generalizált, súlyos kimenetelû betegséget
csak különbözõ okok (AIDS, szerv-transzplantáció, citosztatikus
kemoterápia, stb.) miatt nem immunkompetens gazdában okoznak.
Elõfordulnak azonban olyan típusok is, amelyek fogékony háziállatokban
jellegzetes, súlyos tünetekkel vagy éppen elhullással is járó betegséget
képesek elõidézni (pulykák vérzéses bélgyulladása, Rubarth-kór).
Az emberi adenovírusok intenzív
kutatása mára 51 szerotípus felismerését, a virion felépítésének
meglehetõsen pontos leírását és öt HAdV-típus teljes
genom-szekvenciájának megismerését eredményezte. Elterjedt vélekedés volt, hogy
az állati adenovírusok szerkezete és genomja is a humánokéhoz hasonló lehet. A
gazda- (emlõs vagy madár) eredet alapján két (Mast- illetve Aviadenovirus)
nemzetségbe sorolt vírusok között egyetlen morfológiai különbség az volt, hogy
a madár-adenovírusok minden csúcsán két, általában eltérõ hosszúságú,
fibert lehetett megfigyelni. Szerológiailag is megkülönböztethetõ volt a
két csoport, amennyiben tagjaik genus-specifikus közös komplementumkötõ
antigénnel rendelkeztek, amit agar-gél-immundiffuzióval is ki lehetett mutatni.
A két-genusos rendszertan hiányosságaira már viszonylag korán felhívták a
figyelmet azok az izolátumok, amelyek nem egyértelmûen illettek a
gazdafaj szerinti nemzetségbe. Az ún. 2. alcsoportbeli BAdV-ok különleges
biológiai tulajdonságai (primer borjúhere-szövethez kötött replikáció, alacsony
titer, sajátos magzárványok, fokozott hõtûrõképesség)
között olyan is akadt (agar-gél immundiffuzióban hiányzik a keresztreakció a
többi mastadenovírussal), ami egyéb esetekben általában a genusba sorolás feltétele
volt. Ugyanígy, viszonylag korán kiderült, hogy a fogékony
házityúk-állományokban komoly veszteségeket okozó EDS- (egg drop syndrome)
vírus eltér a madár-adenovírusoktól, és nem rendelkezik a nemzetségre
jellemzõ közös antigénnel. Egy további madár-eredetû adenovírus is
nagyon különlegesnek bizonyult: a pulykák vérzéses bélgyulladását okozó vírus
(“turkey haemorrhagic enteritis virus”, THEV), ami fácánokban ún.
márványlép-betegséget (MSD), házityúkban pedig lép-megnagyobbodással járó
kórképet (splenomegalia) idéz elõ. Bár minden madárból izolált AdV-t az Aviadenovirus nemzetségbe soroltak, azt
a fenti vírusok miatt három csoportra kellett osztani: a nagyszámú “klasszikus”
aviadenovírus (I. csoport) mellett elkülönítve a THEV-szerû vírusokat
(II. csoport) és az EDS-vírust (III. csoport).
Benkõ és munkatársai (1988)
a DNS restrikciós enzimes (RE) analízisével megállapították, hogy ezeknek a
különleges BAdV-oknak kb. 20-30 százalékkal kisebb a genomjuk, mint az 1.
alcsoportba sorolt és a humán adenovírusokra jobban hasonlító BAdV-1 vagy
BAdV-3 vírusé (Benkõ és Harrach, 1990).
Késõbb molekuláris klónozással és DNS-hibridizációs kísérletekkel megállapítottuk,
hogy a két alcsoportba tartozó BAdV-ok között komoly szekvencia hasonlóság
(hibridizálással) nem mutatható ki, azaz genetikailag nem tekinthetõk
közeli rokonoknak (Benkõ et al., 1990).
Célul tûztük ki, hogy DNS-szekvencia szinten is
megismerjük ezeket a különleges BAdV-okat, és az akkoriban még újdonságnak
számító (sõt megkérdõjelezett) számítógépes filogenetikai
analízist alkalmazzuk különbözõségeik kvantitatív jellemzésére. Munkánk
kezdetekor egyetlen 2. alcsoportbeli BAdV-ból származó gén volt ismert. Az
eltelt idõ folyamán szerencsénkre az állati adenovírusok tanulmányozása
is egyre intenzívebbé vált, legelsõsorban azért, mert a rekombináns
technikával elõállított adenovírus-alapú génkifejezõ vektorok
igen hatékony, stabil, biztonságos és jól kezelhetõ rendszernek
bizonyultak (Tuboly et al., 1993; Tuboly
és Nagy, 2001). A téma népszerûsödése nyomán a rendelkezésre álló
génszekvenciák illetve teljes genomok mennyisége ugrásszerûen
megnõtt, ami nagyban elõsegítette filogenetikai elemzéseink
tökéletesedését. A fokozatosan felismert taxonómiai viszonyok alapján
folyamatosan javaslatokat nyújtottunk be az ICTV-hez, kezdetben nem sok
sikerrel. Az áttörést az 1998-as év jelentette, amikor korábbi
erõfeszítéseinkre végre felfigyeltek, és témacsoportunkra bízták az ICTV
Hetedik Jelentéséhez az Adenoviridae
családról szóló fejezet összeállítását (Benkõ et
al., 2000). Mivel ebben a kiadásban már kötelezõen szerepelt a
vírusfaj fogalmának pontos meghatározása minden egyes család esetében,
kénytelenek voltunk ezt a feladatot is felvállalni. Mivel a humán és
madár-adenovírusok kivételével az új speciesek kialakításához igen kevés adat
állt rendelkezésünkre, ez a feladat igen nagy lendületet adott ahhoz, hogy
szekvenáló és elemzõ vizsgálatainkat a laboratóriumunkban megtalálható
illetve vizsgálatra kapott különféle gazda-eredetû adenovírusok minél
szélesebb körére kiterjesszük.
A nemzetség-szintû besorolás néhány olyan érdekes,
kezdetben bizarrnak tûnõ eredményhez vezetett, hogy szükségesnek
láttam bizonyos vírusok gazdafaj-eredetének pontosabb megvizsgálását. Úgy
véltem, hogy csak az “egzotikus” adenovírusok molekuláris szintû tanulmányozása
adhat kulcsot az Adenoviridae család evolúciójának, a
genom-szervezõdés fejlõdési irányának megértéséhez. A kapott
eredmények egyértelmûen arra utalnak, hogy e vírusoknál több esetben
meglepõ gazdaváltás következett be. E gazdaváltások figyelembe vételével
végül is sikerült az adenovírusok evolúciójának legvalószínûbb irányát és
nagy lépéseit felvázolnom. Eddigi vizsgálataink e hipotetikus evolúciós utat
nem cáfolják.
Vírus-törzsek és
elemzésre kapott DNS-szekvenciák eredete
Vizsgálatainkhoz számos magyar illetve külföldi kolléga
nyújtott segítséget különbözõ emlõs- (Bartha Adorján, Rusvai
Miklós, Brian Adair), madár- (Sághy Erzsébet, Palya Vilmos, Brian Adair),
kígyó- (Winfried Ahne) és hal-eredetû (Scott LaPatre) vírustörzsek
rendelkezésünkre bocsátásával. A kígyó-adenovírusok király pitonból (Python regius)
és gabonasiklóból (Elaphe guttata)
származtak, a hal-adenovírust pedig fehér tokból (Acipenser transmontanus) izolálták. Adenovírus
fertõzöttségre (MSD, THE, stb.) gyanús mintákat biztosított Ivanics Éva,
Baska Ferenc, Erdélyi Károly, Földi József, Hajtós István és Vlado Savic.
Mindnyájuknak szeretném köszönetemet ezúton is kifejezni.
Molekuláris klónozás
és DNS-szekvenálás
A BAdV-okat alacsony passzázs-számú
borjúhere- vagy (az 1. alcsoportbelieket) borjúvese-sejttenyészeten, illeve
MDBK-sejtvonalon szaporítottuk, míg az ovin adenovírusokat (OAdV) alacsony
passzázs-számú bárányvese-sejteken. Az ultracentrifugálással cukorpárnán át
ülepítve tisztított vírusok DNS-ét SDS- és proteináz-K-kezelés után fenolos
kivonással és alkoholos kicsapással tisztítottuk. Esetenként közvetlenül a
vírussal fertõzött sejttenyészetbõl nyertünk vírus-DNS-t a
Shinagawa (1983) által ajánlott eljárással. Általában véletlenszerû
molekuláris klónozás alkalmaztunk. A genom-végekrõl alkalikus kezeléssel
távolítottuk el a terminális protein esetleges maradványait, majd tompa- és
ragadós véget eredményezõ két restrikciós enzimmel vágott klónozó vektorba
(pBluescipt SK, pMOB, pUC19, pKH47, pBR322) klónoztuk. Némelykor fizikális
térképezést alkalmaztunk, majd direkt klónozással egyenként építettük be az
elektroforézissel elkülönített ismert fragmentumokat.
A klónozott virális
genom-szakaszok DNS-sorrendjét a végeik felõl a plazmidokhoz illõ
szekvenáló primerekkel (univerzál, reverz, T3, T7) határoztuk meg kezdetben
izotópos (32P vagy 35S) Sanger-féle
dideoxi-láncterminációs módszerrel (Benkõ Mária, Harrach Balázs, Ruzsics
Zsolt), a késõbbiekben pedig automata szekvenálóval, Pharmacia ALF
(Johan Béla Országos Epidemiológiai Központ, Bánrévi Andrea) vagy ALF Express
rendszeren (Országos Állategészségügyi Intézet, Ursu Krisztina, Élõ
Péter), illetve ABI377-es gépen (MTA Szegedi Biológiai Központ, Pay Anikó,
Kószó Zsuzsanna). A szekvenálással nyújtott segítséget hálásan köszönöm.
A teljes szekvenálásra kiválasztott molekulárisan
klónozott vírusgenom-szakaszokat különbözõ módszerekkel készítettük
elõ. Szubklónozást, direkt klónozás alkalmaztunk, ha ismertük a szekvenálandó
szakasz fizikális térképét, vagy legalább néhány fontosabb RE felismerési hely
elhelyezõdését. Ha nem állt rendelkezésünkre fizikális térkép, magunk
kerestünk vágási helyeket és azokat felhasználva visszavágásokkal rövidítettük
a vizsgálandó virális DNS-t kiejtve a klónozóhelyekig (“multiple cloning site”)
terjedõ részt. Kipróbáltunk egy ugrálógénes (transzpozonos)
technikát is, amelynek során a szekvenálandó szakasz különbözõ pontjaira
beépült TN1000 transzpozon végei felõl lehetséges a DNS-sorrend
meghatározása a transzpozonhoz tartozó primerek segítségével. A szükséges
klónok ugyan órák alatt elõállíthatók, ám a nagyméretû (6000 bp)
transzpozon miatt, amit ráadásul minél hosszabb vizsgálandó DNS-szakasz esetén
érdemes alkalmazni, gyakran problémáink voltak megfelelõ
töménységû DNS elõállításával. Néha egyes szakaszok “kiestek”,
valamint a beépülés helyének megállapítása csupán RE vágásokkal nem mindig volt
lehetséges. Exonukleáz III technikával gyorsan és irányított mértékben
tudtunk sorozatos visszavágásokat elérni, de bizonyos genom-szakaszokkal nem
boldogultunk (feltehetõleg a cél-DNS konformációja miatt). Néhány
rövidebb szakaszt, az utolsó megismert szekvencia-rész alapján tervezett egyedi
primerrel szekvenáltattunk (“primer walking”). Ennek különleges esete
volt, amikor egy klónozott szakasz végére tervezett primer segítségével
sikerült tisztított vírus-DNS-t közvetlenül szekvenálni, anélkül, hogy
klónoznunk kellett volna (Szathmáry et al., 1997).
Számítógépes
szekvencia-analízis
A
nyert DNS-szekvenciákat Blast (NCBI, USA) homológia
vizsgálatnak vetettünk alá a klónozott genom-szakasz azonosítására és a
téves klónozások kiszûrésére. Az interneten keresztül a GenBank (NCBI)
adatbázisát használtuk. Az ott található adatok problémás minõsége miatt
(elnevezésbeli hibák, ismétlõdések, bizonyos szekvenciák hiánya),
összeállítottunk egy internetes nyilvános (az Intézet linux-szerverén
elérhetõ) adatbázist (http://www.vmri.hu/~harrach/ADENO1.htm),
mely válogatott, javított és bõvített adenovírus-szekvencia adatokat
tartalmaz, és egy ezt használó Blast szolgáltatást (http://www.vmri.hu/blast.htm).
A belsõ használatra készült munka-adatbázis tartalmazza a nem közölt
(nem végleges) saját szekvenciáinkat is. DNS- és aminosav-szekvencia
gyûjteményünk windows alapú személyi számítógépeken a BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/RnaseP/info/
programs/BIOEDIT/bioedit.html) beépített Blast programjával
vizsgálható.
Az egymást átfedõ DNS-szekvenciák összeillesztését a PC/Gene (IntelliGenetics) vagy a
LaserGene (DNASTAR) programcsomagok Assemgel és SeqMan II programjainak
segítségével végeztük. A DNS- és aminosav-szekvenciákat részben e két
programcsomag segítségével elemeztük (DNS-szekvencia lefordítása
különbözõ leolvasási keretekben, GC% számítása, kódon-használat, stb.).
Ezenkívül internetes szolgáltatásokat és ingyenes célprogramokat alkalmaztunk
az alábbiak szerint.
A Biology WorkBench 3.2 (http://workbench.sdsc.edu)
programgyûjtemény a Blast homológia kereséssel talált hasonló szekvenciák
válogatását, összeillesztését és vizsgálatát könnyíti meg. Kiválaszthatók, pl.
a GenBank vírusszekvencia gyûjteményébõl, a valóban homológ
szekvenciák, majd a programcsomag lehívja ezek teljes szekvenciáját és ClustalW
programmal hasonlósági illesztést (“alignment”) végez.
A filogenetikai számításokat a PHYLIP-programcsomag
különbözõ programjaival (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)
végeztük, ahogy azt részletesen leírtuk (Harrach és Benkõ, 1998a).
DNS- és aminosav-szekvencia-illesztéseket vizsgáltunk parszimónia és távolsági
mátrix (“distance matrix”) analízissel; a kapott fákat a TreeView
programmal (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)
jelenítettük meg.
A gazdaállatokra vonatkozó evolúciós fa részben mitokondriális
riboszóma-RNS kis alegység-szekvenciákon és FastDNAml (maximális hasonlóság,
“maximum likelihood”) számításokon alapult, és a Riboszómális Adatbázisból
(Ribosomal Database) származik (Maidak et al., 1997;
http://rdpwww.life.uiuc.edu/index2.html). Néhány esetben alkalmaztuk a tirozináz-gént is (a
PHYLIP-programcsomag Protdist és molekuláris órát használó Kitch
programjaival).
Adenovírusok
molekuláris klónozása és szekvenálása
Elkészítettük
a BAdV-1 (Benkõ és Harrach, 1990), BAdV-4 (Benkõ
et al., 1990) és BAdV-10 (Matiz et al., 1996)
fizikális térképét. A BAdV-4 és 10 teljes genomját klónoztuk, valamint számos adenovírus
különbözõ genom-szakaszait: BAdV-1–3, 6, 7, 9, OAdV-1, 3, 5, EDS-vírus,
gabonasikló és fehér tok adenovírusai. Más adenovírusok genom-szakaszait
PCR-rel nyertük (Kiss et al., 1996a, b): tyúk-adenovírus 1-4,
6-11, fácánok márványlép-betegségének vírusa, THEV, piton-AdV.
A
GenBankba eddig az alábbi szekvenciákat nyújtottuk be (a részleges
génszekvenciák zárójelben):
Mastadenovírusok
BAdV-1 pVIII, E3-régió, (fiber) AF038868 2607 bp
1997. XII. Evans
et al., 1998
BAdV-2 (protein III), pVII, pV,
pX, (pVI) U44123 2609 bp 1995. XII. Rusvai
et al., 2000
(hexon),
proteáz, (DBP) U44124
836 bp 1995. XII. Barbezange
et al., 2000
fiber, 17K AF308811 2496 bp
2000. IX. Izadpanah et al., 2001
BAdV-10 (52K) U25263 405
bp 1995. IV. Smyth
et al., 1996
(pIIIa) U25262 514 bp
1995. IV. Smyth
et al., 1996
proteáz, (DBP) AF027599 897
bp 1997. IX. Matiz
et al., 1998
ITR AF238882 368
bp 2000. II. Dán et al, 2001
OAdV-3 (hexon), proteáz, (DBP) AF153447
2099 bp 1999. V. Barbezange
et al., 2000
macska-adenovírus izolátum (hexon) AF172246 301 bp
1999. VII. Lakatos et al, 1999
Atadenovírusok
BAdV-4 (pVI), hexon, (proteáz) AF036092
3220 bp 1997. XI Dán et al., 1998
ITR AF238883
59 bp 2000. II. Dán
et al., 2001
teljes genom AF036092
30100 bp 2001. II Dán
et al., 1997, kézirat
BAdV-5 ITR AF238881
67 bp 2000. II. Dán
et al., 2001
BAdV-6 ITR AF238880 74 bp
2000. II. Dán et al., 2001
EDS-vírus (hexon), proteáz, (DBP) U63515 1053 bp 1996. VII. Harrach
et al., 1997
Erszényes róka-AdV penton AF249332 1344 bp 2001. I. Thomson et al., benyújtva
hexon AF338822 2724 bp
2001. I. Thomson et al.,
kézirat
proteáz AF338823 2001. I. Thomson
et al., kézirat
Aviadenovírusok
Tyúk-adenovírus több típusa (hexon) benyújtása
folyik Papp et al., 2001
Siadenovírusok
Béka-AdV 1 teljes genom AF224336 26163 bp
2000. I. Davison et.,
2000
Fácán márványlép betegség vírusa, proteáz, pVIII (hexon) benyújtása most
folyik
A kapott nukleotid-sorrend százalékos GC arányát minden
esetben megvizsgáltuk. Az eltérõ kódon-használat demonstrálásra
jelrendszereket dolgoztunk ki (pl. l, L, l,
L, l,
L a leucint kódoló tripletek megjelenítésére) (Harrach és Benkõ, 1990).
A
vírusgenom szervezõdésérõl részleges szekvenciák alapján is
adatokat nyertünk a jellegzetes gének és genom-régiók vizsgálatával (Matiz
et al., 1998; Szathmáry et al., 1997).
Egyedi
gén-szekvenciákon alapuló számítógépes összehasonlítás
Elsõsorban a proteáz,
hexon, pVIII, DNS-polimeráz és penton-gén DNS- és aminosav-szekvenciákat tanulmányoztuk
számítógépes filogenetikai analízissel.
(Kiegészítõ ábrák az
interneten: hexon
aminosav-szekvenciák illesztése Phylip-formátumban a számításokhoz nem
használható „oszlopok” kivágása után; a distance matrix analízis
eredménye NEXUS formátumban.) Az 1. ábra a hexon
aminosav-szekvenciák távolsági analízissel nyert elemzését mutatja. Hasonló
csoportosítást eredményezett minden tanulmányozott gén és fehérje vizsgálata,
akár DNS-, akár aminosav-szekvenciákat elemeztünk, függetlenül attól, hogy
parszimónia vagy távolsági mátrix analízist végeztünk.
Bár az érthetõség kedvéért
és a csoportunk által közösen végzett munka kiterjedtségének vázolása érdekében
az eredményeknél felvillantottam számos munkát, amit az átfogó
adatgyûjtés érdekében végeztünk tanítványainkkal, téziseimnek fõ
témája a nyert DNS- és származtatott aminosav-szekvenciák számítógépes
filogenetikai analízise és értelmezése, ezért igyekszem ezek megvitatására
szorítkozni.
A 2. alcsoportbeli
BAdV-ok filogenetikai távolsága a mastadenovírusoktól
Munkám
kezdetekor a BAdV-7 proteáz-génjének kivételével nem volt ismert szekvencia a.
2. alcsoportbeli szarvasmarha-adenovírusokból (BAdV-4–8). Mint korábban
említettem, Bartha Adorján már 1969-ben
felismerte, hogy e vírusok biológiai és szerológiai tulajdonságaik alapján
annyira eltérõek az összes többi emlõsállat adenovírusától, hogy
rendszertani elkülönítésük indokolt lenne, de az akkori technika nem tette
lehetõvé az eltérés mértékének kvantitatív meghatározását, vagy olyan
bizonyítékok összegyûjtését, amelyekkel e felismerést rendszertani
szinten is el lehetett volna fogadtatni. A molekuláris biológiai eszköztár
kifejlesztése teremtette meg a lehetõséget a vírusok evolúciós
távolságának kvantitatív tanulmányozására (Harrach, 1998).
A 2. alcsoport tagjainak nukleotid-sorrendje
meglepõen alacsony (34-42%) GC-tartalmú genomról tanúskodott a korábban
megismert adenovírus-szekvenciákhoz képest (43-64%). Ezt a magas AT-arányt
javasoltuk az új nemzetség nevében tükrözni: Atadenovirus genus (Benkő
és Harrach, 1998; Harrach
és Benkõ, 1998a).
Az idõközben teljes egészében
megszekvenált tyúk-adenovírus 1 (CELO) és 9 (A2) genom-analízise azt mutatta, hogy
a két tradicionálisan elfogadott genus kissé eltérõ genom-szerkezettel
rendelkezik (Chiocca et al., 1996; Ojkic
és Nagy, 2000), ami nem váltott ki nagy meglepetést. Szekvenálásaink
azonban azt mutatták, hogy a 2. alcsoportbeli BAdV-ok a két genusétól
eltérõ, harmadik típusú genom-szerkezettel rendelkeznek. E
felfedezésünkkel egyidõben ausztrál kutatók leírták egy juh-adenovírus
(OAV287-es törzs) teljes genom-szekvenciáját és genom-analízisét (Vrati
et al., 1996). Meglepõ eredményeiket összegezve, e
juh-adenovírust mint egy rendkívül különleges adenovírust jellemezték.
Késõbb sikerült befejeznünk a BAdV-4 teljes genomjának DNS-szekvenálását
(Dán et al., 1997; Benkõ et
al., 2001). Ezenkívül a BAdV-5, 6, 7, és az önálló típus-számmal még nem
rendelkezõ Rus-izolátum (Zakharchuk et al., 1993)
hosszabb genom-szakaszainak bázissorrendjét is meghatároztuk (Szathmáry et al., 1997). Eredményeinket összevetve
világossá vált, hogy az OAV287-es törzs és a 2. alcsoportbeli BAdV-szerotípusok
genom-szervezõdése azonos, és valóban jelentõsen különbözik a
mastadenovírusok genomjától. Egyes gének hiányoznak, illetve teljes
genom-régiók nem azonosíthatók. Nevezetesen a protein V és IX génje, valamint
három korai régió (E1, E3 és E4) nincs jelen e vírusokban (Benkõ és Harrach, 1998; Szathmáry et al., 1997; Benkõ
et al., 2001). Mivel ezeket a genom-részeket minden korábban
vizsgált (emlõsállatból izolált) adenovírusban megtalálták, eleinte
hihetetlennek tûnt a felfedezett eltérés. Az ausztrál kutatók maguk is
mindenáron erõltették a korai régiók homológjainak azonosítását. Például
nyomokban fellelhetõnek vélték az E1B-régiót a mastadenovírusoknál
megszokott elhelyezkedésben. Az itt található géneket, amik az Atadenovirus
nemzetség tagjaiban mindig nagyon hasonlítanak egymásra, máig is E1B-régiónak
nevezik, holott a nagyon alacsony pontszámmal kimutatott egyetlen hasonló
mastadenovírus-gén homológiája nem tekinthetõ bizonyítottnak.
Feltételezték továbbá az E3-régió áthelyezõdését, csupán azon az alapon,
hogy a fiber-gént követõen találtak egy kivágható genom-szakaszt (és az
E3 is nélkülözhetõ a vírus számára). Az E4 áthelyezõdését szintén
egy nagyon alacsony pontszámú, feltételezett homológia alapján mondták ki.
Egyszerûbbnek látszik azonban elfogadni, hogy a mastadenovírusok E1, E3 és E4 régióinak homológjai nem léteznek és
valószinûleg soha nem is voltak jelen az atadenovírusok genomjában. Ugyanakkor az atadenovírusok
tartalmaznak más géneket és korai gén-régiókat hasonló genom-elhelyezõdésben.
Például egy struktúrális prekurzor fehérje- (p32K) gén található az E1A helyén,
három korai gén az E1B helyén, valamint további korai gének a genom jobb végén
(Vrati et al., 1996; Benkõ et
al., 2001).
A bioinformatikai eszközökkel (homológia kereséssel)
azonosított géneket kvantitatív, számítógépes filogenetikai elemzéssel
vizsgálva bizonyítottuk, hogy a BAdV 2.
alcsoport tagjai hasonló filogenetikai távolságra helyezkednek el a mastadenovírusoktól,
mint az önálló genusnak elfogadott aviadenovírusok (1. ábra; Benkõ és
Harrach, 1994; Harrach et al., 1996).
Következtetésünk az volt, hogy e BAdV-okat egy új (harmadik) genusba kell
elkülöníteni a genetikai távolság alapján (Benkő
és Harrach, 1998; Dán et al., 1998; Harrach és Benkõ, 1998a és b). A filogenetikai számítások
ugyanebbe a csoportba sorolták az OAV287-es törzset is.
A kacsa-adenovírus 1
rokonsága a szarvasmarha-adenovírusokkal
A
kacsa-adenovírus 1 (EDS-vírus) proteináz-gén DNS-szekvenciájával és
filogenetikai analízissel bizonyítottuk a meglepő tényt, hogy ez a madárból izolált vírus közeli rokona a 2.
alcsoportbeli BAdV-oknak (Harrach et al., 1997).
Közös vírusnemzetségbe való beosztásukat javasoltuk (Atadenovirus genus), annak ellenére, hogy más gerinces osztályba
tartozó állatokból származnak (Benkő és Harrach, 1998).
Időközben közölték az EDS-vírus teljes nukleotid-sorrendjét, és kiderült, hogy
genom-szerveződése nagyjából azonos a kérődzőkből izolált atadenovírusokéval (Hess et al., 1997). Az egyetlen eltérés az, hogy az EDS-vírus
genomja hosszabb, a jobb végén található egyedi szakasszal, amelynek elemzése
még nem fejezõdött be.
A korábbi nevezéktan a háziállatok minden adenovírusát a Mastadenovirus vagy az Aviadenovirus nemzetségbe sorolta. E
nevek egyedül a gazdafajra utalnak, és annak jelentõségét hangsúlyozzák
(bár a szerológiai keresztreakció hiánya is jól elkülönítette ezeket a
vírusokat). Így javaslatunk, hogy bizonyos emlős
és madár-adenovírusokat egy új közös genusba soroljunk, valóban meglepőnek
tûnhetett. Első lépésben nem is sikerült többet elérnünk, mint a javasolt
atadenovírusok eltávolítását a Mastadenovirus
illetve Aviadenovirus nemzetségből,
és átsorolásukat a “be nem sorolt adenovírusok” közé (Benkõ
et al., 2000).
Egy erszényesből
izolált adenovírus
Új-Zélandban
az erszényesróka (közönséges rókakuzu, Trichosurus vulpecula)
béltartalmában elektron-mikroszkóppal adenovírusok jelenlétét mutatták ki. A
vírus vizsgálatát megnehezítette, hogy szövettenyészeten nem sikerült izolálni,
ezért minden egyes szekvenálható DNS-szakaszt PCR-technikával kellett kinyerni.
Az első szekvenciák arra utaltak, hogy egy újabb atadenovírusról lehet szó.
Új-zélandi kollégáink ekkor felvették velünk a kapcsolatot, és további PCR
primerek tervezése céljából különbözõ, még nem közölt DNS-szekvenciákat
bocsátottunk a rendelkezésükre. Mostanra hosszú szakaszokat lehetett felerősíteni
és szekvenálni. A filogenetikai számítások megerősítették, hogy az erszényesróka adenovírusa valóban az
atadenovírusok nemzetségébe tartozik (Thomson et al.,
2001). Az eddig megismert genom-szerveződési adatok szintén alátámasztják
ezt, pl. megállapítottuk az V-ös struktúrprotein génjének hiányát.
Magyarázat az
atadenovírusok hasonlóságára
Az
atadenovírusok különlegességének elfogadását nehezítette, hogy sem az alaposan
tanulmányozott humán, sem pedig a többi emlősállatból izolált adenovírus között
egyetlen hasonlót nem írtak le. Különbözõ kérődző-fajokban azonban
(kecske, szarvas, stb.) újabban több atadenovírust találtak (Lehmkuhl
és Cutlip, 1999), és mára a kérődzőkből izolált adenovírus típusoknak közel
a fele idetartozik. Mi lehet a magyarázata, hogy ezek a különleges vírusok csak
kérődzőkben, kacsában (onnan csirkére is terjedve) és erszényesben fordulnak elő?
Feltételezzük, hogy az atadenovírusoknak
közös az eredete, valamilyen más (nagyon eltérő) állatcsoporttal fejlődhettek
együtt az evolúció során, és viszonylag “nem régen” adaptálódtak a ma ismert új
gazdákhoz. Az atadenovírusok jelenléte három ennyire távoli rendben/alrendben
arra enged következtetni, hogy ez a
gazdaváltás három eltérő időpontban történt, feltehetõen az után,
hogy a gazdaállatok elkülönültek egymástól az evolúció során, mivel eddigi ismereteink
szerint más állatfajokban atadenovírusok nem fordulnak elõ és nincs
okunk kihalásukat bizonyos gazdában feltételezni. Az eredet kiderítése céljából
összehasonlítottuk a gazdaállatok és a belőlük izolált vírusok filogenetikai
fáját.
A gazdaállatok evolúciós fáját olyan génnel kívántuk
ábrázolni, amely minél több fajból rendelkezésünkre állt. Elsőként a
mitokondriális riboszóma-RNS kis alegységét választottuk (Harrach, 2000). Sajnos ez a gén nem
alkalmas a régebbi evolúciós történések rekonstruálására, mert a kapott
törzsfejlődési fa nem mutatja mindig helyesen a gerincesek evolúciós
távolságát. Ezért csak hozzávetőleges következtetés levonására használható. Azt
mindenesetre látni, hogy az atadenovírusok olyan evolúciós távolságra vannak a
többi adenovírustól, hogy eredeti gazdáikat valamilyen alacsonyabbrendű
gerincesben lehet feltételezni. A kérdés pontos meghatározása azonban (e gén
esetében mindenesetre) meghaladta a számítások feloldóképességét. Ezért az
eredet megállapítása céljából hozzákezdtünk az alacsonyabbrendű gerincesekből
(hal, béka, kígyó) izolált adenovírusok molekuláris jellemzéséhez.
A béka-adenovírus
közeli rokona a pulyka-HEV-nek
Kézenfekvõnek
látszott a béka-adenovírus vizsgálata, mivel ez a vírus, és a szaporításához
felhasználható sejtvonal megvásárolható az American Type Culture
Collection-tõl. Kiderült, azonban, hogy Skóciában már meg is kezdték e
vírus DNS-ének szekvenálását. A filogenetikai elemzéshez és a kapott eredmények
értelmezéséhez együttmûködésre kértek fel. Analízisünk azt a
meglepõ eredményt adta, hogy a
béka-adenovírus a pulykák vérzéses bélgyulladásának vírusával (THEV,
pulyka-adenovírus 3) mutat nagyon közeli rokonságot (Davison et al., 2000). E
meghökkentõ eredményt magyarázhatja elméletünk, miszerint a madarakból izolált THEV eredetileg a
kétéltûekkel fejlõdött együtt. Emlékeztetõül
megjegyzem, hogy a THEV nem ad szerológiai kereszt-reakciót az
aviadenovírusokkal (“II. csoport”).
A béka-adenovírus és a THEV közös csoportja olyan
filogenetikai távolságra van a másik három (elfogadott illetve javasolt)
genustól, hogy egy negyedik adenovírus nemzetségnek tekintendõ.
Javaslatunkat alátámasztja a jellegzetesen eltérõ
genom-szervezõdés is, ugyanakkor a két tag genom-szervezõdése
megegyezik. A mastadenovírusok E1A-régiójának helyén ezekben a vírusokban egy
szialidáz- (neuroaminidáz-) gén-homológ található, ezért a nemzetség nevéül a Siadenovirus-t javasoltuk (Davison és Harrach, 2001).
Az
atadenovírusok eredete
A
béka-adenovírus jellemzésével nagy valószinûséggel kizártuk azt, hogy
kétéltûek adenovírusaiból származnának az atadenovírusok.
Megközelítõen azonos evolúciós távolságra levõ állatcsoportot
keresve a halak és a hüllõk jöhettek szóba, melyekbõl az utóbbit
valószinûsítettük (Harrach, 2000).
Feltételezésünk helytállóságát jelenleg vizsgáljuk. Egy király pitonból és egy gabonasiklóból
izolált adenovírus genom-szakaszait szekvenálva, elõzetes filogenetikai
elemzéseink egyelõre megerõsítik, hogy mindkét
hüllõ-adenovírus atadenovírus, sõt, e genus jellegzetességét, a
p32K-gént is megtaláltuk. Megjegyzem, hogy munkatársaim hal-adenovírus
szekvenálásával kapott eredményei az atadenovírusok hal-eredetét viszont
kizárják. A fehér tokból izolált adenovírus DNS-szekvenciájának elemzése arra
utal, hogy a hal-adenovírusok egy újabb genust alkotnak. Pillanatnyilag úgy
tûnik, hogy talán minden gerinces
osztály adenovírusát külön nemzetségbe kell majd besorolni.
Az eltelt (százmillió?) évek alatt egymástól a
“faj-korláttal” elválasztva függetlenül fejlõdött vírusoknál
jelentõs mértékben eltérõ genom-szervezõdés alakult ki.
Genetikai különbözõségük az egyedi gének filogenetikai elemzésével
könnyen mérhetõ. A megértést a korábban fel nem ismert gazdaváltások
nehezítették (kétéltûbõl pulykába; hüllõbõl kacsába,
[õs-] kérõdzõbe, erszényesrókába).
Bár a molekuláris evolúciós események pontos
idõrendiségének számításos megállapítását több tényezõ nehezíti
(pl. a gének evolúciójának eltérõ sebessége, a molekuláris órát
alkalmazó számítógépes programok megbízhatatlansága), az adenovírusok és
gazdaállataik együttes evolúciója alapján kísérletet tehetünk a ma
létezõ adenovírus nemzetségek elkülönülésének idõpontjának
megbecslésére. Feltételezve, hogy a tokból izolált adenovírus végig a “csontos
halakkal”, pontosabban a sugarasúszójú halakkal (Actinopterygii)
fejlõdött, a béka-adenovírus, kígyó-adenovírus, vagy a tipikus
emlõs- és madár-adenovírusok pedig ezekkel a származási vonalakkal,
akkor feltételezhetjük, hogy adenovírusok legalább 450 millió éve léteznek
(sugarasúszójú halak kialakulása; Kumar and Hedges, 1998),
a siadenovírusok (csupasztestû kétéltûek, Lissamphibia) kb. 360
millió éve különültek el, a mastadenovírusok pedig 310 millió éve (Synapsida
[emlõsök] és Diapsida [“hüllõk” és madarak] szétválása). Hasonló
feltételezés alapján az atadenovírusok 276 millió éve fejlõdhetnek
függetlenül, mert a Lepidosauria alosztály (hidasgyíkok, pikkelyes
hüllõk) 276 millió éve különült el a molekuláris számítások szerint (Kumar and Hedges, 1998), az aviadenovírusok pedig 222 millió
éve (a madarak és krokodilok egymástól való elkülönülésének becsült ideje).
Természetesen, ma még nem tudjuk, hogy a krokodil- (vagy teknõs-)
adenovírusok melyik adenovírus genus tagjaihoz lesznek majd hasonlók. Az
adenovírusok ennél régebbi elõfordulására (adenovírus leírása
õsibb állatfajban) még nincs adat. Bár a PRD1 baktérium-fágban hexon- és
pentonszerû fehérjét valamint ITR-szerû genomvég-ismétlõdést
véltek felfedezni (Benson et al., 1999),
ami az adenovírusok bakteriális eredetére is utalhat, kellõ hasonlóságú
DNS-szekvenciák hiányában mi nem tudtuk vizsgálni ezt a kérdést.
Egyes szerotípusok
eredete
A BAdV-2 valójában
ovin eredetû
Filogenetikai
számításaink azt mutatják, hogy a BAdV-2 nagyon közeli rokona a juh-adenovírus
2–5 szerotípusoknak, és közelebb áll ezekhez, mint más BAdV-okhoz. Ezzel
szemben az 1-es szerotípusú juh-adenovírus távolabb áll e csoporttól. A korábbi
klasszikus virológiai vizsgálatok eredményei, melyek szerint a BAdV-2 juhokban
is nagyon gyakori (Belák és Pálfi, 1974;
Belák et al., 1986; Rusvai
és Fodor, 1998) kézenfekvõ a következtetés, hogy ez a
vírus eredetileg juh adenovírus volt. Feltehetõleg késõbb
adaptálódott szarvasmarhához, és véletlenül elsõ izolálása is
ebbõl a fajból történt.
Az OAV287 esetleg
kecske-eredetû
Az
OAV287 genomjának leírása (egyszerûen “juh-adenovírusként” említve),
amikor más juh-adenovírusból még egyáltalán nem volt ismert DNS-szekvencia,
kissé félrevezetõ hatással járt. Sokakban azt a képzetet keltette, hogy
minden juh-AdV izolátum atadenovírus. Valójában a helyzet éppen fordított, öt
elismert és tanulmányozott OAdV tipikus mastadenovírus. A DNS-szekvenciák
hiánya miatt elkezdtük az OAdV-ok szekvenálását és filogenetikai elemzését (Barbezange et al., 2000).
Hosszabb-rövidebb szekvenciát nyertünk mind az öt említett szerotípusból és a
filogenetikai analízis bizonyította ezeknek a mastadenovírusokhoz való
tartozását. Megerõsítettük a DNS-hibridizációs eredményeken alapuló
korábbi feltételezéseket, hogy az OAdV-1 elkülönül az egymáshoz nagyon
hasonlító OAdV-2–5 és BAdV-2-tõl.
Honnan származhat az ausztrál OAV287
izolátum, miért nem találtak eddig hozzá hasonlót Európában? A nemrég közölt
kecske-adenovírus DNS-szekvenciájának (Lehmkuhl
et al., 1999) filogenetikai analízise az OAV287-tel való
közeli rokonságra utal (1. ábra). Elképzelhetõ
tehát, hogy az eredeti gazda esetleg kecske, amelynek adenovírusait eddig
kevésbé vizsgálták.
Majom-eredetû
HAdV-ok?
A majom-adenovírusok további jó
példát szolgáltatnak arra, hogy egy vírus jelenlegi gazda-spektruma nem minden
esetben döntő a vírus jellemzése szempontjából. Filogenetikai számításaink az
elérhető (kevésbé megbízható, rövid) VA-RNS-génre (Kidd et al.,
1995), néha a hexonra és néhány részleges egyéb gén-szekvenciára
támaszkodva azt mutatják, hogy egyes simian adenovírusok (SAdV) sokkal közelebb
állnak bizonyos HAdV-okhoz, mint a HAdV-ok egymáshoz (1. ábra).
Úgy tûnik, hogy az ismert öt csimpánz-adenovírusból a SAdV-21 a HAdV-ok B
csoportjába, a SAdV-22–25 az E csoportba tartozik. Mivel az 51 ismert HAdV
közül csupán egyetlen tartozik az utóbbi csoportba (HAdV-4), ezért lehetséges,
hogy a csimpánzokkal együtt fejlődött csoportról van szó, amelynek egyetlen
tagja megjelent az emberben is. A főemlősök adenovírusainak időnkénti gazdacseréjére
látszólag mindkét irányban van lehetőség. A fenti elmélkedést folytatva, a
népes HAdV B csoportban megjelenő egyetlen csimpánz-adenovírus (SAdV-21) humán
eredetűnek vélhető. (A nagyon változékony E3-régió megőrzöttsége az említett
csoportokon belül szintén mutatja e csoportosítások helytállóságát.) Mindezek
alapján jogos, hogy a gazdaeredet csak egy a speciest
meghatározó kritériumok között (lásd késõbb).
Az Adenoviridae család molekuláris
evolúciójának lehetséges irányai,
közös származott tulajdonságok
Az adenovírusok
genom-variációit tekintve adódik a kérdés a fejlõdés irányára
vonatkozóan, hogy az evolúció során rövidül vagy nõ-e a genom hossza.
Amennyiben elfogadjuk, hogy a hidegvérû gerincesek eddig vizsgált
adenovírusai hûen tükrözik a többi oda tartozó vírus tulajdonságait,
néhány tanulság levonható.
Az eddig megismert legõsibb AdV- (a
béka-adenovírus-) genom a legrövidebb, ezt a másik
kétéltû-eredetûnek feltételezett AdV (pulyka-adenovírus 3) genomja
követi, majd a hüllõ-eredetûnek gondolt atadenovírusok. Ez arra a
logikus lehetõségre utal, hogy az õs-adenovírus genomja rövid
volt, a replikációhoz szükséges minimális információt hordozta. Az evolúció
során a vírusgenom fokozatosan nõtt és környezetébõl, pl. a
gerinces állatok kromoszómáiból vett fel egyre újabb DNS-szakaszokat. Jó példa
erre a dUTPáz-enzim génje, ami a tyúk-adenovírusok mellett néhány
emlõs-adenovírusban is felbukkan. Összehasonlítva az avi- és
mastadenovírusok, valamint a gerincesek dUTPáz-génjeit kiviláglik, hogy az
adenovírusok két genusában elõforduló gének nem hasonlítanak jobban
egymásra, mint a gerincesekben fellelhetõk (tehát feltehetõleg az
AdV-dUTPáz-gének nem egymásból fejlõdtek ki lassú evolúcióval). A két
genus (egyes) vírusai legalább két különbözõ idõpontban vették
fel e gént (esetleg akár annak duplikációból eredõ különbözõ
változatait). Ha ez az esemény a két vírus-genus szétválása elõtt történt
volna, akkor feltehetõen az összes mastadenovírus genomban benne lenne a
gén. A siadenovírusok szialidáz-génjéhez nagyon hasonló gén elõfordul
baktériumokban és eukaryotákban (így gerinces állatokban) is, de a virális gén
származása bizonytalan.
Más korai gének eredetét még nem ismerjük, vagy csak
feltevéseink vannak, de jellemzõ, hogy a vírus ezeket a szaporodását,
túlélését segítõ géneket az evolúció során megõrzi. A
vírus-genuson vagy annak kisebb csoportjain belül megõrzött, közös
származott tulajdonságok segítik a vírusok csoportosítását is. Így eddig minden
mastadenovírusban találtak E1A és B régiót a genom bal végén. Ugyanott, minden
aviadenovírusban dUTPáz-gént, az atadenovírusokban p32K-gént, a
siadenovírusokban szialidáz-homológ-gént látunk. Más genushoz tartozó
adenovírusban viszont nem fordulnak elõ ezek a gének. (A néhány
mastadenovírus által feltehetõleg függetlenül felvett dUTPáz-gén a genom
ellenkezõ végén található.) Ugyanígy minden mastadenovírusban van
protein V- és IX-gén, E3- és E4-régió, de ezek hiányoznak minden más AdV
genomjából. (A siadenovírusban az E3 helyén talált gén, vagy az
atadenovírusokban az E4 helyén található gének, nem homológok a
mastadenovírusok génjeivel.) Úgy tûnik, hogy a “vírussal
összefüggõ RNS” (“virus associated RNA”, VA-RNS) gén csak a fõemlõsök
adenovírusaiban fordul elõ. (A hasonló néven leírt tyúk-adenovírus
VA-RNS nem mutat semmilyen homológiát ezekkel.)
Az adenovírusok fordított vég-ismétlõdéseinek
(“inverted terminal repeat”, ITR) hossza is jellegzetes. Természetesen ezek
összehasonlításakor el kell tekintenünk az ITR-nél leírt
ismétlõdésektõl (Fejér et al., 1992). Az
ITR legrövidebb a béka-adenovírusnál (36 bp) és a THEV-nél (39 bp). Alig
hosszabb az atadenovírusok és aviadenovírusok ITR-je: 46-74 bp (Dán et al., 2001). A mastadenovírusok viszont
számtalan szabályozófehérje (NFI, NFIII, Sp1, ATF) kötõhelyet vettek fel
feltételezhetõen a gazdáik kromoszómáiból, és ITR-jük mindig aránylag
hosszú (93-368 bp). Az eddig talált leghosszabb ITR az általunk szekvenált
BAdV-10-ben fordul elõ (Dán et al., 2001).
Eddigi koevolúciós feltételezéseinket elfogadva azt kell
gondolnunk, hogy a legtöbb adenovírus fejlõdése pontosan követte gazdáik
fejlõdését. Ahogy elkülönültek a halak, a kétéltûek, aztán az
emlõsök, majd végül a hüllõk és madarak, úgy váltak külön
evolúciós ágakra az adenovírusok is. Ettõl való eltérést csak a
feltételezett gazdaváltások eredményeztek, a kétéltûekbõl és
hüllõkbõl a madarakra és emlõsökre. Ha ez kellõen
régen történt, akkor mára már az új gazdában is több vírustípus alakult ki,
mint pl. a kérõdzõknél, akár egyetlen fajon, a szarvasmarhán
belül is (BAdV-4–8).
Taxonómiai problémák
A korszerû vírus taxonómiától is elvárható, hogy
lehetõleg az evolúció történéseit tükrözze, és ne mereven támaszkodjon
olyan, néha félrevezetõ, kritériumokra, mint pl. az elsõként
megismert vagy jelenlegi gazdafaj. Filogenetikai számításaink megteremtették a
lehetõséget, hogy pontos, bárki által megismételhetõ számításokra
alapozott rendszertani beosztásokra tegyünk javaslatokat az Adenoviridae
család esetén. Eddigi ismereteink alapján legalább öt adenovírus nemzetséget
kell elkülöníteni (még a gazdákra alapozva is, ha mindig az eredeti gazdából
indulunk ki). Ezek konkrét elnevezése már kevésbé tudományos kérdés. Mindesetre
a mast- és aviadenovírus elnevezés annyiban továbbra is helyes, hogy minden oda
tartozó vírusra érvényes (pl. minden mastadenovírust emlõsbõl
izoláltak). Ugyanakkor emlõs- és madárfajokból izoláltak
egyértelmûen más genushoz tartozó AdV-ket is. A halak adenovírusait
lehetne pl. Ichtadenovirus nemzetségnek nevezni, mert ilyen vírusokat
eddig más állatfajban nem találtak. Problémásabb a helyzet azoknál az
adenovírusoknál, amelyek több gerinces-osztály fajaiban is elõfordulnak.
Lehetõleg olyan elnevezést kellene választani, ami az összes tagra
jellemzõ tulajdonságra utal. Az eddig összesen két tagot számláló Siadenovirus
nemzetség elnevezése egyelõre helyes.
A vírus species
Az ICTV 2000-ben megjelent Hetedik Jelentésének szerkesztői
követelményként kötötték ki a species (vírusfaj) fogalmának pontos
meghatározását minden vírus-család esetében. Az adenovírusoknál évekig csak a
szerotípusokat tartották számon, mivel ez pontosan definiálható volt a
neutralizációs próbában megfigyelt keresztreakciók hiánya, illetve számszerű
mértéke szerint. Nem pontosan tisztázott alapon egyes kutatók a típusokat
nevezték speciesnek, holott ezzel kapcsolatban végleges megállapodás feltehetőleg
nem volt. Köztudott azonban, hogy a szerológiai alapon két külön típusba sorolt
HAdV-2 és 5 DNS sorrendje 98%-ban megegyezik, más típusok nukleotid-sorrendjétől
viszont jelentősen eltér. A minden egyes típus egy species elv nem
szolgáltatott semmi többlet információt az egyes típusok egymáshoz viszonyított
rokonságának fokára vonatkozóan. Új koncepciót dolgoztunk ki, melynek alapjául
a HAdV-ok csoport (subgenus) beosztását találtuk alkalmasnak. A különböző
biológiai és szerológiai (hemagglutinációs) tulajdonságok alapján korábban
felállított hat csoport (A–F) lett a hat HAdV-species. Ezt a meglehetősen régi
csoportosítást ugyanis filogenetikai számításaink is megerősítették. A
tyúk-adenovírusok (FAdV) esetében hasonló csoportosítást állított fel Zsák és Kisary (1984) a vírus DNS RE mintázata alapján, melyet
DNS-szekvenálással és filogenetikai számításokkal megerõsítettünk (Papp et al., 2001). Mivel az öt FAdV csoportot is betűkkel
jelölték, a specieseknek is a gazdafaj–betű elnevezést ajánlottuk (Harrach, 2001). A rendelkezésre álló szekvenciák
filogenetikai analízisének eredménye alapján megkíséreltük az eddig ismert
állati eredetű típusok speciesbe sorolását (Benkõ
et al., 2000). Természetesen néhány olyan vírusfajt is ki kellett
alakítani, amelynek egyelőre csak egy típus a képviselője.
A vírusfaj, mint rendszertani egység a meghatározás
szerint ún. polythetikus kategória, azaz nincs egyetlen olyan tulajdonság sem,
amellyel feltétlenül rendelkeznie kell a kategóriába sorolandó minden egyednek.
Ugyanakkor, általában a vírusfajnak nincs egyetlen olyan képviselője sem,
amelyre valamennyi kritérium érvényes lenne. A gyakorlatban tehát a vírusfajba
sorolás feltételeit érdemes úgy megválasztani, hogy azok közül néhánynak a
megléte meghatározza a besorolást. Az adenovírusok esetében javaslatot
dolgoztunk ki, de a rendelkezésünkre álló idő rövidsége miatt nem sikerült
széleskörű megvitatásra bocsátani. Az első lépést azonban megtettük, és
jelenleg gyűjtjük az adenovirológusok véleményét, ötleteit, javaslatait. Az
ICTV Hetedik Jelentésében az alábbi kritériumok
szerepelnek: gazda-eredet, meghatározott mértékű egy vagy kétirányú
keresztreakció vírus-neutralizációs próbában, DNS-hibridizáció, RE mintázat
hasonlósága, azonos méretű fragmentumok száma, rekombinációs képesség,
hemagglutinációs tulajdonságok, százalékos GC-tartalom, filogenetikai távolság
meghatározott mértéke, stb. (Benkõ et al., 2000).
Néhány meglepõ közös fajba sorolás: BAdV-2 és
OAdV-2–5 (GC%, gazda, filogenetikai számítás); bizonyos majom- és humán
adenovírusok (hemagglutinácó, keresztneutralizáció, szekvencia-adatok); OAV287
és az 1-es szerotípusú kecske-adenovírus. Mivel a kutya-adenovírusokat számos,
a Ragadozók rendjéhez tartozó fajból izolálták már (pl. medve, róka, stb.),
ezért vírusfaj névnek az általánosabb Carnivore
adenovirus nevet javasoljuk. Hasonlóképpen a majom- és humán
adenovírusfajok mindkettõre jellemzõ neve a Primate adenovirus A–F lenne, a kérõdzõké pedig Ruminant adenovirus, mivel a bovin és
ovin izolátumok mellett egyre nõ a különbözõ szarvas-fajokból,
bivalyból, házi és vadkecskébõl izolált törzsek száma. Bizonyítékaink
vannak a keresztfertõzésekre is, pl. dámszarvasban BAdV-6 fordult
elõ (Boros et al., 1985).
A vírusfajok (és neveik) pontosítása folyamatosan zajlik a nyert szekvenciák
tanulmányozásával. A jelenleg aktuális javaslat az alábbi.
Mastadenovírus genus Aviadenovírus genus (jellemzõ törzs)
Carnivore adenovirus [CAdV-1, 2] Fowl
adenovirus A [FAdV-1] (CELO)
Equine
adenovirus A [EAdV-1] B [FAdV-5] (TR22)
B [EAdV-2] C
[FAdV-4 10] (KR-5, CFA20)
Guinea
pig adenovirus [GPAdV-1] D
[FAdV-2, 3, 9, 11]
Murine
adenovirus A [MAdV-1] (685, SR49, A2, 380)
Porcine
adenovirus A [PAdV-1–3] E
[FAdV-6–8] (168, X-11, TR59)
B [PAdV-4] Goose adenovirus [GoAdV-1–3]
C [PAdV-5]
Primate adenovirus A [HAdV-12, 18, 31; Feltételezett species a genusban
SAdV-2–4, 6, 9, 10, 11, 14; Duck
adenovirus B [DAdV-2]
csimpánz AdV Y34] Pigeon adenovirus [PiAdV-1]
B [HAdV-3, 7,
11, 14, 16, 21, Turkey adenovirus B
[TAdV-1, 2]
34, 35, 50; SAdV-21]
C [HAdV-1, 2,
5, 6; BAdV-9; Atadenovirus genus
SAdV-13, 26?/C2]
D [HAdV-8, 9,
10, 13, 15, 17, Duck adenovirus [DAdV-1 (EDS-vírus)]
19, 20,
22–30, 32, 33, Marsupial adenovirus [PoAdV-1]
36–39, 42–49, 51] Ruminant atadenovirus A [BAdV-4–6,
8]
E [HAdV-4;
SAdV-22–25] B
[BAdV-7]
F [HAdV-40,
41; SAdV-16, 19] C
[OAdV-7 (OAV287),
Ruminant adenovirus A [BAdV-1] GadV-1]
B [BAdV-3] D [OdAdV-1]
C [BAdV-10] Snake adenovirus
[SnAdV-1]
D [OAdV-1]
E [OAdV-2–5;
BAdV-2] Feltételezett species a genusban
F [GAdV-2] Ruminant atadenovirus
E [OAdV-6]
Tree shrew adenovirus
[TSAdV-1]
Siadenovirus
genus
Feltételezett
species a genusban
Murine adenovirus B
[MAdV-2] Frog adenovirus [FrAdV-1]
Simian adenovirus
[SAdV-1, 5, 7, 8, 12, 15, 17, Turkey adenovirus A [TAdV-3 (THEV,
MSDV)]
18,
20, 27?]
GenBank-káosz – a
javított és normalizált on-line adatbázisunk
Munkánk során, fõleg
kezdetben komoly gyakorlati problémát jelentett, hogy a különbözõ
kutatók által a szekvencia-adatbázisokba benyújtott adatok nevezéktani hibáinak
kiszûrésére nincs hatékony és automatikus mechanizmus. Egy kirívó példa a
tengerimalac-AdV, ami a GenBank szerint egy nem
azonosított sertés-AdV. Egy másik példa, a penton-gén a FAdV-10-bõl,
amit ”Mastadenovirus
fowl10” névvel jelölnek. További probléma, hogy ha a kutatók nem nyújtják
be a kódolt fehérjék aminosav-szekvenciáját is, akkor azok hiányoznak a
fehérje-adatbázisból, és a homológia keresõ programok nem találhatják
meg, mégha egy vírus egész genomja ismert is. Erõfeszítéseket tettünk
ezért a mások által benyújtott adenovírus-adatokban talált hibák kijavítására.
Egyrészt saját adatbázist készítettünk a javított adatokkal (http://www.vmri.hu/~harrach/ADENO1.htm).
Felállítottunk egy interneten elérhetõ homológia keresõ programot
is a jelenleg leghatékonyabb ilyen program, a Blast-programcsomag
felhasználásával, ami saját adatainkkal összehasonlítva vizsgálja a beküldött
szekvenciát (http://www.vmri.hu/blast.htm).
Másrészt az amerikai GenBank illetékeseivel elfogadtattuk javaslataink
többségét. Ezzel már az ICTV hivatalos (lassú és bürokratikus) jóváhagyása
elõtt sikerült a négy genusos adenovírus-beosztás gyakorlati
alkalmazását bevezetni. Végül elhelyeztünk az interneten egy összefoglaló
táblázatot, aminek segítségével azonnal megállapítható, hogy melyik
adenovírusból milyen DNS-szekvencia ismert, és ezek közvetlenül el is
érhetõk (http://www.vmri.hu/~harrach/ADENOSEQ.HTM).
Hasonlóan lehívható innen a fontosabb fehérjék szekvencia-illesztése, valamint
az azokon alapuló törzsfejlõdési fák.
Összefoglalva munkámat úgy vélem, hogy
számos állati adenovírus-genom DNS-szekvenciájának megismerése és filogenetikai
elemzése utat nyitott az adenovírusok rokonsági viszonyainak és evolúciós
múltjának felderítéséhez, és lehetõvé tette egy korszerû taxonómia
alapjainak kialakítását.
LEGFONTOSABB EREDMÉNYEIM ÉS
MEGÁLLAPÍTÁSAIM
1.
Filogenetikai számításokkal
bizonyítottam, hogy a 2. alcsoportbeli bovin adenovírusok evolúciós szempontból
legalább olyan távol esnek a mastadenovírusoktól, mint az aviadenovírusok.
2.
Elsõként állapítottuk meg, hogy az 1-es szerotípusú kacsa-adenovírus
(EDS-vírus) és a 2. alcsoportbeli bovin adenovírusok közeli rokonságban állnak.
3.
Több BAdV-genom vizsgálata során a genom-szervezõdésben olyan
jelleg-zetességeket tártunk fel, melyek alapján javaslatot tettünk egy új (harmadik)
nemzetség felállítására az Adenoviridae
családon belül (Atadenovírus).
4.
Megállapítottuk, hogy az erszényesróka adenovírusa is atadenovírus.
5.
A béka-adenovírus teljes genomjának analízisével megállapítottuk, hogy az
legjobban egy pulyka-adenovírus (THEV) genomjához hasonlít. Javaslatot tettünk
egy negyedik genus létrehozására e vírusok besorolásához.
6.
Felismerni vélem, hogy minden gerinces osztály saját (vele végig együtt
fejlõdött) adenovírusát külön vírusnemzetségbe kellene besorolni.
7.
Kidolgoztunk egy új vírusfaj koncepciót (az adenovírus-szerotípusok
csoportosítása), amit az ICTV elfogadott.
8.
A gazdafajok és vírusainak evolúciós fáját összehasonlítva hipotézist
állítottam fel az adenovírusok törzsfejlõdésének irányára és az
atadenovírusok hüllő-eredetére, amit a kígyó-adenovírus most folyó szekvenálása
bizonyítani látszik.
9.
DNS-szekvenálás és/vagy filogenetikai számítások alapján úgy véljük, hogy a
bovin adenovírus 2 juh-eredetű. A juhból izolált OAV287 jelû törzs
kecskéből kerülhetett az új gazdára. A HAdV-4 pedig eredetileg csimpánz-vírus
lehetett.
10.
Interneten elérhetõ (javított) szekvencia-adatbázist és erre
alapított homológia kereső programot tettünk elérhetővé adataink és az általunk
javasolt taxonómia megismertetésére és népszerûsítésére.
Ádám É, Nász I, Lengyel A
(1996) Characterization of adenovirus hexons by their epitope
composition. Arch Virol 141:1891-1907
Ádám É, Rusvai M, Lengyel A,
Belák S, Nász I (1988) Antigenic relationship between human and animal
adenovirus hexons determined by means of monoclonal antibodies directed against
bovine adenovirus type 2 hexon. Arch Virol 100:9-15
Barbezange
C, Benkõ M, Dán Á, Harrach B (2000) DNA
sequencing and phylogenetic analysis of the protease gene of ovine adenovirus 3
suggest that adenoviruses of sheep belong to two different genera. Virus Res
66:79-85 (teljes
cikk)
Bartha A (1969) Proposal
for subgrouping of bovine adenoviruses. Acta Vet Hung 19:319-321
Belák S, Berencsi Gy, Rusvai
M, Lukács K, Nász I (1983) DNA structure, and hemagglutination properties of bovine
adenovirus type 2 strains which bypass species specificity. Arch Virol
77:181-194
Belák S, Pálfi V (1974) An
adenovirus isolated from sheep and its relationship to type 2 bovine
adenovirus. Arch Ges Virusforsch 46:366-369
Belák S, Virtanen A, Zabielski
J, Rusvai M, Berencsi Gy, Pettersson U (1986) Subtypes of
bovine adenovirus type 2 exhibit major differences in region E3. Virology
153:262-271
Benkõ M, Bartha A, Wadell G (1988) DNA restriction
enzyme analysis of bovine adenoviruses. Intervirol 29:346-350
Benkõ
M, Dán Á, Bánrévi A, Harrach B (2001) Analysis of the complete genome sequence of bovine
adenovirus type 4 confirms the characteristic features of the members of the
new genus Atadenovirus. GenBank Accession
number AF036092
Benkõ
M, Harrach B (1990)
Restriction site mapping of bovine adenovirus type 1. Acta Vet Hung 38:281-284
Benkõ
M, Harrach B (1994) Identification
of the proteinase gene of bovine adenovirus type 4. Acta Microbiol Immunol Hung
41:323
Benkõ
M, Harrach B (1998) A proposal for establishing a new (third) genus within
the Adenoviridae family. Arch Virol
143:829-837
Benkõ M, Harrach B, DHalluin JC (1990) Molecular
cloning and physical mapping of the DNA of bovine adenovirus serotype 4 study of the DNA
homology among bovine, human and porcine adenoviruses. J Gen Virol 71:465-469
Benkõ
M, Harrach B, Russell WC (2000): Family Adenoviridae.
van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM,
Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB (szerk) Virus Taxonomy.
Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the International
Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, pp. 227-238
Benson SD, Bamford JK, Bamford DH, Burnett RM (1999) Viral evolution
revealed by bacteriophage PRD1 and human adenovirus coat protein structures.
Cell. 98:825-833
Boros G, Gráf Z, Benkõ
M, Bartha A (1985) Isolation
of a bovine adenovirus from fallow deer (Dama
dama). Acta Vet Hung 33:119-123
Chiocca S,
Kurzbauer R, Schaffner G, Baker A, Mautner V, Cotten M. (1996) The
complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. J
Virol 70:2939-2949 (teljes
cikk)
Dán Á,
Benkõ M, Zádori Z, Bánrévi A, Ursu K, Harrach B (1997) Unusual genome organization of bovine adenovirus type 4.
Acta Microbiol Immunol Hung 44:34
Dán Á, Élõ P, Harrach
B, Zádori Z, Benkõ M (2001) Four new inverted terminal repeat sequences from bovine
adenoviruses reveal striking differences in the length and content of the ITRs.
Virus Genes 22:175-179
Dán Á, Ruzsics Zs, Russell WC,
Benkõ M., Harrach B (1998) Analysis
of the hexon gene sequence of bovine adenovirus type 4 provides further support
for a new adenovirus genus (Atadenovirus).
J Gen Virol 79:1453-1460 (teljes cikk)
Davison A, Harrach B (2001) Genus Siadenovirus. Tidona CA, Darai G (szerk) The Springer Index of Viruses,
Springer-Verlag, Heidelberg (nyomdában)
Davison AJ,
Wright KM, Harrach B (2000) DNA
sequence of frog adenovirus. J Gen Virol 81:2431-2439 (teljes cikk)
Evans PS, Benkõ M,
Harrach B, Letchworth GJ (1998) Sequence, transcriptional analysis and deletion of the
bovine adenovirus type 1 E3 region. Virology 244:173-185
Fejér
Gy, Berencsi Gy, Ruzsics Zs, Belák S, Linne T, Nász I (1992) Multiple enlargements in the right inverted terminal
repeat of the DNA of canine adenovirus type 2. Acta Microbiol Hung 39:159-168
Harrach
B (1998) Biotechnológia az
állategészségügyben. Dudits D, Dohy J (szerk) Biotechnológia: lépéstartás
Európával. (Magyarország az ezredfordulón. Stratégiai kutatások a Magyar
Tudományos Akadémián. II. Az agrárium helyzete és jövõje) Magyar
Tudományos Akadémia, Budapest pp. 121-155
Harrach B (2000) Reptile
adenoviruses in cattle? Acta Vet Hung 48.485–490
Harrach B (2001) Genus Aviadenovirus. Tidona CA, Darai G (szerk) The Springer Index of Viruses.
Springer-Verlag, Heidelberg (nyomdában)
Harrach B, Benkõ M (1990) Alternating
one-letter symbols for the representation of codon variations at the level of
amino acid sequences. Acta Vet Hung 38:285-286
Harrach B,
Benkõ M (1998a) Phyogenetic analysis of adenovirus sequences; proof of
necessity of establishing a third genus in the Adenoviridae family. Wold WSM (szerk) Adenovirus Methods and
Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol. 21) Humana Press, Totowa, NJ,
USA pp 309-339
Harrach B,
Benkõ M (1998b) Miért provokálnak vitát még ma is az Áldásy által több
mint 30 éve izolált adenovírusok? Magy Állatorv Lapja 120:650-651
Harrach B, Evans
P, Rusvai M, Bánrévi A, Berencsi Gy, Benkõ M (1996) DNA sequencing
and phylogenetic analysis of bovine adenovirus types 1, 2, 3, 4, 7, 9, and 10
justify the existence of two subgroups. Acta Microbiol Immunol Hung 43:206
Harrach B, Meehan BM, Benkõ M, Adair BM, Todd D
(1997) Close phylogenetic relationship between egg drop
syndrome virus, bovine adenovirus serotype 7, and ovine adenovirus strain 287.
Virology 229:302-306
Hess M, Blöcker H, Brandt P
(1997) The complete nucleotide sequence of the egg drop syndrome
virus: an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses. Virology
238:145-156
Izadpanah R, Benkõ M, Ursu K,
Dán Á, Rusvai M, Harrach B (2001) Characterisation of the fiber gene and partial sequence
of the early region 4 of bovine adenovirus 2. Acta Vet Hung 49: 245-253
Kidd AH, Garwicz D, Öberg M
(1995) Human and simian adenoviruses: phylogenetic inferences
from analysis of VA RNA genes. Virology 207:32-45
Kiss I, Matiz K, Allard A,
Wadell G, Benkõ M (1996a) Detection of homologous DNA sequences in animal
adenoviruses by polymerase chain reaction. Acta Vet Hung 44:243-251
Kiss I, Matiz K, Bajmóci E,
Rusvai M, Harrach B (1996b) Infectious
canine hepatitis: detection of canine adenovirus type 1 by polymerase chain
reaction. Acta Vet Hung 44:253-258
Kumar S, Hedges SB (1998) A molecular timescale for vertebrate evolution. Nature
392:917-920
Lakatos B, Farkas J, Egberink
HF, Vennema H, Horzinek MC, Benkõ M (1999) Detection
of adenovirus hexon sequence in a cat by polymerase chain reaction. Acta Vet
Hung 47:493-497
Lehmkuhl HD, Cutlip RC (1999) A new goat adenovirus isolate proposed as the prototype
strain for goat adenovirus serotype 1. Arch Virol 144:1611-1618
Maidak BL, Olsen GJ, Larsen N,
Overbeek R, McCaughey MJ, Woese CR (1997) The RDP (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res
25:109-111
Matiz K, Benkõ M,
Zádori Z, Harrach B (1996)
Restriction site mapping of a bovine adenovirus type 10 strain. Acta Vet Hung
44:389-394
Matiz K, Ursu K, Harrach B,
Zádori Z, Benkõ M (1998) Sequencing and phylogenetic analysis of the protease
gene, and genetic mapping of bovine adenovirus type 10 define its relatedness
to other bovine adenoviruses. Virus Res 55:29-35 (teljes
cikk)
Ojkic D, Nagy É (2000) The
complete nucleotide sequence of fowl adenovirus type 8. J Gen Virol
81:1833-1837 (teljes
cikk)
Papp T, Dán
Á, Palya V, Révész T, Ivanics É, Glávits R, Sági E, Harrach B (2001) Study of fowl adenoviruses by PCR and DNA sequencing.
Acta Microbiol Immunol Hung 48:263-264
Rusvai M,
Fodor L (1998) Occurrence of some viruses and bacteria involved in
respiratory diseases of ruminants in Hungary. Acta Vet Hung 46:405-414
Rusvai M, Harrach B, Bánrévi A, Evans PS,
Benkõ M (2000) Identification and sequence analysis of the core
protein genes of bovine adenovirus 2. Virus Res 70:25-30
(teljes
cikk)
Shinagawa M, Matsuda A, Ishiyama T, Goto H, Sato G
(1983) A rapid and simple method for preparation of adenovirus DNA from
infected cells. Microbiol Immunol 27:817-822
Smyth JA, Benkõ M,
Moffett DA, Harrach B (1996) Bovine adenovirus type 10 identified in fatal cases of
adenovirus-associated enteric disease in cattle by in situ
hybridization. J Clin Microbiol 34:1270-1274 (teljes
cikk)
Szathmáry
R, Barbezange C, Dán Á, Harrach B. (1997) Simultaneous physical and genetic mapping of viruses:
cloning, sequencing, and mapping of the genome of bovine adenovirus type 6.
NADC First Int Virtual Conf Infectious Dis Animals. ápr 20-máj 2, NADC Ames,
Iowa, B00011
Thomson D, Meers J, Harrach B
(2002) Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail
possums (Trichosurus vulpecula). Virus Res 83:189-195 (teljes
cikk)
Tuboly T, Nagy É (2001) Construction
and characterization of recombinant porcine adenovirus serotype 5 expressing
the transmissible gastroenteritis virus spike gene. J Gen Virol 82:183-190 (teljes cikk)
Tuboly T, Nagy É, Derbyshire
JB (1993) Potential viral vectors for the stimulation of mucosal
antibody responses against enteric viral antigens in pigs. Res Vet Sci
54:345-350
Vrati S, Brookes DE, Strike P,
Khatri A, Boyle DB, Both GW (1996) Unique
genome arrangement of an ovine adenovirus: identification of new proteins and
proteinase cleavage sites. Virology 220:186-199
Wigand R, Bartha A, Dreizin
RS, Esche H, Ginsberg HS, Green M, Hierholzer JC, Kalter SS, McFerran JB,
Petterson U, Russell WC, Wadell G (1982) Adenoviridae: second report. Intervirol 18:169-176
Zakharchuk
AN, Kruglyak VA, Akopian TA, Naroditsky BS, Tikchonenko TI (1993) Physical
mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA. Arch
Virol 128:171-176
Zsák L, Kisary J (1984) Grouping of fowl adenoviruses based upon the restriction
patterns of DNA generated by BamHI and HindIII. Intervirology
22:110-114.
A TÉZISEK ALAPJÁT KÉPEZÕ
KÖZLEMÉNYEK
1. Harrach B,
Meehan BM, Benkõ M, Adair BM, Todd D (l997): Close phylogenetic
relationship between egg drop syndrome virus, bovine adenovirus serotype 7, and
ovine adenovirus strain 287. Virology
229. 302-306.
2. Dán Á, Ruzsics Zs, Russell WC, Benkõ M, Harrach B (1998): Analysis of the hexon
gene sequence of bovine adenovirus type 4 provides further support for a new
adenovirus genus (Atadenovirus). J Gen Virol
1453-1460 (teljes
cikk)
3. Harrach B, Benkõ M (1998): Phylogenetic analysis of
adenovirus sequences; proof of the necessity of establishing a third genus in
the Adenoviridae family. In Wold WSM (szerk.): Adenovirus Methods and Protocols.
Methods in Molecular Medicine. Humana
Press, Totowa, NJ, USA, pp. 309-339.
4. Benkõ M, Harrach B, Russell WC (2000):
Family Adenoviridae. van Regenmortel
MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo
MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB (szerk.): Virus
Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of
the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego,
pp. 227-238.
5. Barbezange CM, Benkõ Á, Dán B, Harrach B (2000): DNA sequencing and phylogenetic
analysis of the protease gene of ovine adenovirus 3 suggest that adenoviruses
of sheep belong to two different genera. Virus
Res 66. 79-85. (teljes
cikk)
6. Davison AJ, Wright KM, Harrach B (2000): DNA sequence of frog adenovirus. J Gen Virol
81. 2431-2439 (teljes cikk)
7. Harrach B (2000):
Reptile adenoviruses in cattle? Acta Vet Hung 48.
485–490.
8. Dán Á, Élõ P, Harrach B, Zádori Z,
Benkõ M (2001): Four new inverted terminal repeat sequences from bovine
adenoviruses reveal striking differences in the length and content of the ITRs.
Virus
Genes 22. 175-179
9 Davison A, Harrach B (2002): Genus Siadenovirus.
In Tidona CA, Darai G (szerk.) The
Springer Index of Viruses, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New
York, pp. 29-33
10. Harrach B (2002): Genus Aviadenovirus.
Tidona CA, Darai G (szerk.) The
Springer Index of Viruses. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New
York, pp. 9-18
11. Thompson D, Meers J, Harrach B, (2002):
Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail possums (Trichosurus
vulpecula). Virus Res
83:189-195 (teljes
cikk)
EGYÉB KIEGÉSZÍTŐ INFORMÁCIÓK
|
|
|
|
|
|
